Biology

प्रेरण और जीर्ण - relapsing प्रायोगिक Autoimmune Encephalomyelitis के क्लीनिकल स्कोरिंग

Published: July 4, 2007 doi: 10.3791/224

Christine Beeton¹, Adriana Garcia¹, K. George Chandy¹

¹Department of Physiology and Biophysics, University of California, Irvine (UCI)

Summary

पुरानी relapsing के महंगाई भत्ते चूहों में प्रयोगात्मक autoimmune Encephalomyelitis: यह वीडियो एकाधिक काठिन्य के एक पशु मॉडल की प्रेरण और नैदानिक स्कोरिंग को दर्शाता है. रोग, एक पूरे चूहे रीढ़ की हड्डी और पूरा है Freund सहायक युक्त पायसन के साथ immunizing चूहों द्वारा प्रेरित, नैदानिक लक्षण मानव रोग जैसी प्रस्तुत करता है.

Abstract

एकाधिक काठिन्य (एमएस) केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (CNS) प्रणाली है कि आमतौर पर युवा वयस्कों को प्रभावित करता है एक जीर्ण सूजन की बीमारी है. यह demyelination और मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी में फैलाया क्षेत्रों में glial डरा द्वारा विशेषता है. इन घावों तंत्रिका प्रवाहकत्त्व बदलने और अक्षम न्यूरोलॉजिकल घाटा है कि CNS (जैसे paraparesis, पक्षाघात, असंयम अंधापन,) में demyelinated सजीले टुकड़े के स्थान के साथ बदलती प्रेरित.

प्रायोगिक autoimmune Encephalomyelitis (EAE) एमएस के लिए एक मॉडल है. EAE पहली बार मानव में रेबीज के खिलाफ टीकाकरण के दौरान गलती से, प्रेरित खरगोश स्पाइनल तार पर हो वायरस का उपयोग करते हुए. निष्क्रिय वायरस के साथ रीढ़ की हड्डी में इंजेक्शन के Residues सीएनएस रोग प्रेरित किया. इन टिप्पणियों के बाद, EAE पहला मॉडल की एक गैर मानव प्राइमेट नदियों द्वारा homogenate और 1935 में Schwenther सीएनएस के साथ प्रतिरक्षित में वर्णित किया गया था. EAE के बाद प्रजाति की एक किस्म में उत्पन्न किया गया और विभिन्न प्रजातियों / तनाव पर निर्भर करता है और प्रतिजन इस्तेमाल किया immunizing पाठ्यक्रम का पालन कर सकते हैं. उदाहरण के लिए, सहायक के साथ पायसन में माइलिन बुनियादी प्रोटीन के साथ लुईस चूहों immunizing EAE के एक तीव्र मॉडल लाती है, जबकि एक ही प्रतिजन गिनी सूअरों में एक पुरानी बीमारी लाती है.

EAE मॉडल यहाँ वर्णित डीए चूहे रीढ़ की हड्डी के खिलाफ पूरा है Freund सहायक में पायस में डीए चूहों immunizing से प्रेरित है. चूहे 7-14 के बाद टीकाकरण दिनों के भीतर एक आरोही झूलता हुआ पक्षाघात का विकास. नैदानिक लक्षण कई सप्ताह से अधिक relapsing-remitting के पाठ्यक्रम का पालन करें. पैथोलॉजी सीएनएस और demyelination सजीले टुकड़े में बड़े प्रतिरक्षा पैठ से पता चलता है. EAE के साथ जानवरों के लिए देखभाल करने के लिए विशेष कारणों से वीडियो के अंत में वर्णित हैं.

Protocol

प्रेरण और जीर्ण - relapsing EAE के निगरानी

पायस पूरक पूरा Freund सहायक जोडी जलीय समाधान में प्रतिजन की एक 1:1 मिश्रण है. यह बहुत महत्वपूर्ण है और दूसरे दौर की तरह नहीं सहायक प्रतिजन जोड़ने!

वहाँ कचरे का एक बहुत कुछ है जब बना रही है और एक रासायनिक पायस इंजेक्शन. हमेशा 1.5 या 2 बार तुम क्या जरूरत से अधिक तैयार.

Autoclaved मोर्टार, मूसल, कांच के सीरिंज, और पुलों का प्रयोग करें. सभी प्लास्टिक बाँझ होना चाहिए. तैयारी एक नियमित प्रयोगशाला बेंच पर किया जा सकता है.

1. पूरक सहायक तैयार

माइकोबैक्टीरियम तपेदिक (Difco सूची # 231,141) और एक मोर्टार में जगह के 30 मिलीग्राम वजन. पतली पाउडर में भी मुश्किल दबाने के बैक्टीरिया को तोड़ने से बचने के बिना बनाओ. Freund सहायक H37Ra (Difco सूची # 231,131) और मिश्रण को पूरा करने के 10 मिलीलीटर जोड़ें. यह पूरक सहायक अब 4 मिलीग्राम / एमएल माइकोबैक्टीरियम क्षयरोग शामिल हैं. एक ट्यूब के लिए स्थानांतरण.

2. रीढ़ की हड्डी homogenate की तैयारी

डीए चूहों (उम्र / उदासीन लिंग) और स्टोर -80 में जमे हुए डिग्री सेल्सियस से रीढ़ की हड्डी डोरियों लीजिए 01:01 (वज़न: मात्रा) मिश्रण के लिए पर्याप्त है पूरक सहायक के साथ जमे हुए स्पाइनल तार का वजन. के रूप में रीढ़ की हड्डी डोरियों के रूप में ठीक एक धार के साथ संभव कीमा, 1 अनुभाग में इस्तेमाल किया मोर्टार के लिए स्थानांतरण, और मूसल के साथ एक पेस्ट करें.

3. पायस की तैयारी

जगह एक ट्यूब में Freund सहायक पूरा पूरक. उच्च गति पर भंवर. जबकि vortexing ड्रॉप के द्वारा रीढ़ की हड्डी homogenate बूंद जोड़ें. जब रीढ़ की हड्डी homogenate के सभी जोड़ा जाता है 5 मिनट के लिए भंवर. मिश्रण हल्के गुलाबी बारी चाहिए.
एक 5 मिलीलीटर गिलास सिरिंज में पायस रखो और यह एक और 5 मिलीलीटर गिलास सिरिंज का उपयोग कर एक 18G पुल के लिए लिंक (फिशर सूची 14-825-17L #). दूसरे के लिए एक सिरिंज से पायस भेजें जब तक यह मुश्किल (5-10 मिनट) हो जाता है. यदि पायस के अधिक से अधिक 5 मिलीलीटर तैयार है, का उपयोग, कई 5 मिलीलीटर सीरिंज बड़ा सीरिंज का उपयोग नहीं करते हैं.
पायस 4 ° C पर सीरिंज में 3 सप्ताह के लिए भंडारित किया जा सकता है. मैं अग्रिम में यह कम से कम 12 घंटे की तैयारी के लिए जाँच है कि यह नीचे तोड़ नहीं करने की सलाह देते हैं. यह मोटी और 2 चरणों में अलग नहीं रहना चाहिए. रंग रातोंरात एक पीला या beige प्रकाश में बदल जाएगा.

4. चूहों का टीकाकरण

कुछ मिनट के लिए सीरिंज में पायस मिक्स और इंजेक्शन के लिए प्रयोग किया जाता सिरिंज करने के लिए स्थानांतरण. अल्पकालिक संज्ञाहरण के अंतर्गत 23g सुइयों और 3 मिलीलीटर Luer-बंद सीरिंज का उपयोग पूंछ के आधार पर 200 μl subcutaneously इंजेक्षन.
प्राप्तकर्ताओं 7-9 सप्ताह पुरानी मादा चूहों डीए हैं. हम Harlan Sprague Dawley से हमारे चूहों को मिलता है.
चूहे दो बार दैनिक मनाया जाना चाहिए और दैनिक तौला. नैदानिक लक्षण 7-15 दिनों पायस के इंजेक्शन के बाद की उम्मीद कर रहे हैं.

क्लीनिकल स्कोरिंग:

0: कोई रोग

0.5: बाहर का लंगड़ा पूंछ

1: लंगड़ा पूंछ

2: हल्के paraparesis, गतिभंग

3: मध्यम paraparesis, समय समय पर चूहों यात्राएं

3.5: एक पिछले अंग झोले के मारे हुए है, अन्य चाल

4: पूरा हिंद अंग पक्षाघात

5: पूरी तरह से पिछले अंग पक्षाघात और असंयम

6: मरणासन्न, साँस लेने में कठिनाई, खाने या नहीं पी है. तुरंत euthanize.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

इस प्रोटोकॉल के लिए कुछ महत्वपूर्ण विचार कर रहे हैं.

डीए चूहों के जेनेटिक्स थोड़ा ब्रीडर जो वे से खरीदे जाते हैं पर निर्भर करता है अलग होगा. इन मतभेदों को बढ़ाने या चूहों की संवेदनशीलता के प्रेरण EAE कम हो सकती है. यदि आपका चूहों अधिक EAE करने के लिए अतिसंवेदनशील हैं आप गैर पूरक पूरा Freund सहायक या अधूरा Freund सहायक का उपयोग करके प्रतिरक्षण की ताकत को कम करना चाहते हैं जाएगा. आप भी पायस तैयार करने से पहले इंजेक्शन पायस की राशि को कम करने या नमक के साथ रीढ़ की हड्डी homogenate गिराए पर विचार कर सकते हैं. यदि आपके चूहों EAE के नैदानिक लक्षण immunizing पायस अपने आवास की सुविधा के सफाई की जांच पूरी शक्ति का उपयोग विकसित नहीं है. परजीवी (जैसे pinworm) के साथ संक्रमित चूहे EAE विकास नहीं होगा. आप फिल्टर में सबसे ऊपर के साथ autoclaved पिंजरों में क्लीनर की शर्तों के तहत अपने पशुओं के आवास, और उन्हें acidified पानी विज्ञापन libitum (acidified पानी तैयार करने के लिए प्रोटोकॉल संलग्न है) देने पर विचार कर सकते हैं.

पानी में तेल पायस किया जाना चाहिए इतना है कि तेल सहायक में पूरी तरह से आप ड्रॉप द्वारा ड्रॉप जोड़ने प्रतिजन कोट. एक रासायनिक पायस तैयार दूसरे दौर की तरह (तेल में पानी) मोटी के रूप में हो जाएगा, लेकिन encephalitogenic नहीं होगा.

चूहे के अनुकूल जानवर हैं अगर वे अपने हैंडलर के आदी रहे हैं, इसलिए यह encephalitogenic पायस के इंजेक्शन से पहले एक दैनिक आधार पर उन्हें धीरे संभाल के लिए एक अच्छा विचार है. यह तनाव और एक काटने का खतरा कम हो जाएगा.

गंभीर EAE (3 या अधिक के स्कोर) के साथ पशु विशेष देखभाल की जरूरत है. चूहे पूंछ द्वारा बल्कि लेकिन शरीर द्वारा कभी नहीं उठाया जाना चाहिए. यह भी बीमार पशुओं में तनाव को कम करने के लिए और अधिक महत्वपूर्ण है. यह बहुत महत्वपूर्ण है करने के लिए सुनिश्चित करें कि सभी जानवरों बिस्तर में भोजन और जेल पैक डालने और पानी की बोतलों पर लंबे समय से sipper ट्यूबों उपलब्ध कराने के द्वारा भोजन और पानी के लिए उपयोग किया है. EAE के साथ चूहे खाने और पीने के जारी रखने के लिए, यदि एक जानवर रोक या तो खाने या पीने के अपने संस्थान के पशु चिकित्सक से परामर्श या जानवर euthanize. बीमार चूहों स्वस्थ पशुओं से अलग किया जाना चाहिए करने के लिए सुनिश्चित करें के लिए वे लगातार नहीं कुचल कर रहे हैं, लेकिन अकेले छोड़ने चूहों से बचने के बाद से वे सामाजिक जानवर हैं और कंपनी की जरूरत है.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

सीबी और KGC Airmid इंक के लिए और सह संस्थापक सलाहकार हैं

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Complete Freund’s Adjuvant	Reagent	Fisher Scientific	DF 311-360-5	Manufactured by Difco
Mycobacterium tuberculosis H37Ra	Reagent	Fisher Scientific	DF3114-33-8	Manufactured by Difco
DA rat	Animal	Harlan Laboratories		Females, 7-9 weeks old.
Glass syringes - 5 ml	Tool	Fisher Scientific	14-823-10 B
Metal bridge - 18G	Tool	Fisher Scientific	14-825-17L
Luer Lok plastic syringes - 3 ml	Tool	BD Biosciences	309585
Needles - 20G 1 1/2	Tool	Fisher Scientific	14-826-5C