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Biology

誘導および慢性-再発実験的自己免疫性脳脊髄炎の臨床スコアリング

doi: 10.3791/224 Published: July 4, 2007

Summary

DAラットの慢性再発性実験的自己免疫性脳脊髄炎:このビデオでは、多発性硬化症の動物モデルの誘導と臨床スコアを示しています。全体ラット脊髄と完全フロイントアジュバントを含むエマルジョンをラットを免疫することにより誘導される疾患は、、人間の病気に似た臨床症状を示しています。

Abstract

多発性硬化症(MS)は、一般的に若い成人に影響を与える中枢神経系(CNS)の慢性炎症性疾患である。それは脳と脊髄に散在地域における脱髄とグリア瘢痕によって特徴づけられる。これらの病変は、神経の伝導を変更し、中枢神経系の脱髄斑(例:対麻痺、麻痺、失明、失禁)の位置によって変化無効に神経学的欠損を引き起こす。

実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)はMSのためのモデルです。 EAEは、最初のウサギの脊髄上に成長させたウイルスを使用して、狂犬病予防接種の間に人間に誤って誘導した。不活化ウイルスによる脊髄注入の残基は、中枢神経系疾患を誘発した。これらの観​​察に続いて、EAEの最初のモデルは1935年に河川によってホモジネートCNSとSchwentherで免疫した非ヒト霊長類に記載されていた。 EAEはそれ以来、様々な種で生成されており、種/系統と使用される免疫抗原に応じてさまざまなコースをたどることができます。同じ抗原がモルモットにおける慢性疾患を誘導しながら例えば、アジュバントとエマルジョンのミエリン塩基性蛋白質とのLewisラットを免疫すると、EAEの急性モデルを誘導する。

EAEモデルここで説明するが、完全フロイントアジュバントでエマルジョン中のDAラット脊髄に対してDAラットを免疫することによって誘導される。ラットは7〜14日後の予防接種の中で昇順弛緩性麻痺を開発する。臨床症状は数週間にわたって再発寛解型経過をたどる。病理学は、中枢神経系脱髄斑の大きい免疫浸潤を示しています。 EAEと動物のために世話をするための特別な考慮事項は、ビデオの最後で説明されています。

Protocol

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慢性再発性EAEの誘導とモニタリング

エマルジョンは、補足完全フロイントアジュバントに添加水溶液中の抗原の1:1混合物である。それは、アジュバントとしない他の方法でラウンドして抗原を追加することが非常に重要です!

作り、エマルジョンを注入する際に廃棄物がたくさんある。常に必要なものよりも1.5〜2倍以上を準備。

オートクレーブ乳鉢、乳棒、ガラスの注射器、およびブリッジを使用してください。すべてのプラスチックは無菌でなければなりません。準備は、通常の実験台で行うことができます

1。補足アジュバントの調製

乳鉢に結核菌 (Difco社のカタログ#231141)と場所の30 mgを秤量する。細菌を破ることを避けるためあまりにもハードキーを押すことなく、薄い粉末にしてください。完全フロイントアジュバントH37Ra(Difco社製カタログ#231131)とミックスの10 mlを追加します。この補足アジュバントは現在、4 mg / mlの結核菌が含まれいます。チューブに移す。

2。脊髄ホモジネートの調製

DAラット(年齢/性別無関心)から脊髄を収集し、-80凍結℃で保存補足アジュバントを1:1(容積重量)を混在させるのに十分持っている冷凍脊髄を量る。カミソリの刃を持つできるだけ細かいとして脊髄をミンチ、セクション1で使用したモルタルに転送、および乳棒を用いてペーストを作る。

3。エマルションの調製

  1. 場所は、チューブのフロイントアジュバントを完了補った。ハイスピー​​ドでボルテックス。ボルテックスしながらドロップで脊髄ホモジネートドロップを追加。さらに5分間脊髄ホモジネートのすべてが追加され、渦。混合物は薄いピンクを有効にしてください。

  2. 5 mlのガラス製の注射器でエマルジョンを入れ、(フィッシャーのカタログ#14から825 - 17L)18Gのブリッジを使用して別の5mlのガラス製注射器にリンクします。それがハードになる(5〜10分)まで、シリンジから他にエマルジョンを送る。エマルジョンのより5mlを準備している場合、いくつかの5mlの注射器が大きい注射器は使用しないでください使用。

  3. エマルジョンは3週間は4℃で注射器に格納することができます。私はそれが崩壊しないことをチェックするため、事前にそれを少なくとも12時間の準備をお勧めします。それは厚さ2段階に分離されていないままにしてください。色は黄色またはベージュの光に一晩変更されます。

4。ラットの予防接種

  1. 数分間シリンジでエマルジョンを混合し、注射用注射器に移す。短期的な麻酔の下に23G注射針および3mLルアーロックシリンジを用いて尾の非常ベースで皮下に200μlを注入する。

  2. 受信者は、7〜9週齢の雌性DAラットです。我々は、ハーラン - スプラーグドーリーから我々のラットを得る。

  3. ラットを毎日二度見して毎日検討する必要があります。臨床徴候は7-15日エマルジョンの注入後に期待されています。

臨床スコア:

0:無症

0.5:遠位足を引きずる尾

1:足を引きずる尾

2:軽度の不全対麻痺、運動失調

3:中等度の対麻痺、時々ラット旅行

3.5:ある後肢が麻痺され、その他の動き

4:完全な後肢の麻痺

5:完全な後肢の麻痺や失禁

6:瀕死状態、呼吸困難、飲食していません。すぐに安楽死させる。

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Discussion

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このプロトコルにはいくつかの重要な考慮事項があります。

DAラットの遺伝学は、それらがから購入されているブリーダーによって多少異なります。これらの違いは、誘導をEAEラットの感受性を増減する場合があります。あなたのラットはEAEに影響を受けやすい場合には、非添加の完全フロイントアジュバント、あるいは不完全フロイントアジュバントを使用することによって予防接種の強さを減らすことになるでしょう。また、エマルジョンを調製する前に注入または生理食塩水で脊髄のホモジネートを希釈乳剤の量を減らすことを考慮することがあります。あなたのラットは、エマルジョンがあなたの住宅施設の清浄度を確認する免疫フル強度を用いてEAEの臨床症状を発症しない場合。寄生虫(など蟯虫など)に感染したラットは、EAEを開発しません。あなたは、フィルタ - トップスオートクレーブケージの掃除機の条件であなたの動物を収容し、それらに酸性の水を自由に摂取(酸性の水を調製するためのプロトコルが接続されている)を与えることを考慮することがあります。

乳剤はアジュバント中の油が完全にコートでは、滴ずつ追加抗原をするように、油中水型にする必要があります。他の方法でラウンド(水中油型)準備エマルジョンは、厚いなることがありますが、脳炎誘発されません。

ラットは、友好的な動物であり、彼らが彼らのハンドラに慣れているなら、それはしたがって、脳炎誘発性エマルジョンの注入の前に日常的にやさしく、それらを処理することをお勧めします。これはストレスと咬合のリスクが軽減されます。

重篤なEAE(3以上のスコア)を持つ動物は、特別な注意が必要です。ラットは尾ではなく、ボディによって選ばれることはありません。これは、病気の動物にストレスを減らすためにさらに重要になります。それはすべての動物は寝具に食べ物やゲルパックを入れて、水のボトルに長いシッパーチューブを提供することにより、食料や水へのアクセスを持っていることを確認することが重要です。動物が食べたり研究所の獣医に相談したり、動物を安楽死させる飲むのどちらかが停止した場合EAEとラットは、食べたり飲んだり続けます。病気のラットは、彼らが常に踏みにじられないように健康な動物から分離、彼らは社会的動物であり、会社が必要となるので、単独でラットを残して避ける必要があります。

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Disclosures

CBとKGCはAirmid社の共同創設者およびコンサルタントです。

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Complete Freund’s Adjuvant Reagent Fisher Scientific DF 311-360-5 Manufactured by Difco
Mycobacterium tuberculosis H37Ra Reagent Fisher Scientific DF3114-33-8 Manufactured by Difco
DA rat Animal Harlan Laboratories Females, 7-9 weeks old.
Glass syringes - 5 ml Tool Fisher Scientific 14-823-10 B
Metal bridge - 18G Tool Fisher Scientific 14-825-17L
Luer Lok plastic syringes - 3 ml Tool BD Biosciences 309585
Needles - 20G 1 1/2 Tool Fisher Scientific 14-826-5C

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Beeton, C., Garcia, A., Chandy, K. G. Induction and Clinical Scoring of Chronic-Relapsing Experimental Autoimmune Encephalomyelitis. J. Vis. Exp. (5), e224, doi:10.3791/224 (2007).More

Beeton, C., Garcia, A., Chandy, K. G. Induction and Clinical Scoring of Chronic-Relapsing Experimental Autoimmune Encephalomyelitis. J. Vis. Exp. (5), e224, doi:10.3791/224 (2007).

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