Métodos para manipulações experimentais após a transecção do nervo óptico no sistema nervoso central de mamíferos

Summary

Transecção do nervo óptico é um modelo amplamente utilizado de lesão do SNC adulto. Este modelo é ideal para a realização de uma série de manipulações experimentais que visam a retina globalmente ou diretamente a população-alvo feridos neuronal de células ganglionares da retina.

Abstract

Células ganglionares da retina (RGCs) são neurônios do SNC que a informação de saída visual da retina para o cérebro, através do nervo óptico. O nervo óptico pode ser acessado dentro da órbita do olho e completamente seccionado (axotomized), cortando os axônios de toda a população RGC. Transecção do nervo óptico é um modelo reprodutível de morte celular por apoptose neuronal no SNC adulto ^1-4. Este modelo é particularmente atraente porque a câmara vítrea do olho funciona como uma cápsula para entrega de drogas para a retina, permitindo manipulações experimentais através de injeções intra-ocular. A difusão de substâncias químicas através do fluido vítreo garante que eles agem sobre toda a população RGC. Vetores virais, plasmídeos ou curto RNAs de interferência (siRNAs) também pode ser entregue à câmara vítrea, a fim de infectar ou transfecção as células da retina ^12/05. O tropismo elevado de vírus adeno-associado (AAV) vetores é benéfico para RGCs alvo, com uma taxa de infecção de aproximadamente 90% de células perto do local da injeção ^{6, 7, 13-15.} Além disso, RGCs pode ser seletivamente transfectadas aplicando siRNAs, plasmídeos ou vetores virais para o fim do corte do nervo óptico ^16-19 ou vetores injetar seu alvo o colículo superior ^10. Isso permite que os pesquisadores a estudar mecanismos apoptóticos na população neuronal feridos sem efeitos de confusão sobre os neurônios ou células gliais bystander outras circunvizinhas. RGC apoptose tem uma característica de tempo-curso em que a morte da célula é retardado postaxotomy 3-4 dias, após o qual as células degeneram rapidamente. Isso proporciona uma janela para manipulações experimentais contra processos envolvidos na apoptose. Manipulações que visam directamente o RGCs do tronco do nervo óptico transeccionados são realizadas no momento da axotomia, imediatamente após o corte do nervo. Em contraste, quando as substâncias são entregues via uma rota intra-ocular, que pode ser injetado antes da cirurgia ou durante os primeiros três dias após a cirurgia, que precede o início da apoptose em RGCs axotomized. No presente artigo, demonstramos vários métodos para manipulações experimentais após a transecção do nervo óptico.

Protocol

1. Técnica Cirúrgica

1. Experimentos devem ser realizados com técnica asséptica e seguindo os protocolos de uso de animais de sua instituição específica. Instrumentos e materiais (soluções, as substâncias, marcadores, agulhas, etc) entrem em contacto com tecidos vivos, deve ser esterilizado para evitar infecções e impactos negativos no bem-estar animal e os potenciais impactos negativos sobre o estudo.

2. Anestesia

1. Ratos serão anestesiados utilizando um sistema vaporizador veterinária isoflurano. Uso de oxigênio classe médica a uma taxa de 0,8 L / min para vaporizar o gás isoflurano. Colocar o animal na caixa de anestesia em anexo e marcar em uma concentração de isoflurano de 4%, até a respiração desacelerou e se o animal está tranqüilo.
2. Em seguida, mudar o fluxo de gás para o anexo máscara de gás para o quadro estereotáxico e colocar o animal no aparelho estereotáxico. Por sua vez a concentração de isoflurano para 2% e monitorar anestesia. Animais de maior porte (> 300g) pode exigir uma maior concentração de isoflurano. A anestesia deve ser monitorizada durante a cirurgia e dosagem isoflurano ajustado em conformidade. Profundidade e taxa de respiração deve ser constantemente avaliados e avaliação toe pitada (a cada 5 minutos) para a ausência de dor profunda deve ser realizada.
3. Uma vez que a cirurgia está completa, desligue o isoflurano e permitir que o animal ao oxigênio da respiração por vários minutos antes da remoção do dispositivo estereotáxico. Temperatura corporal deve ser mantida, cobrindo o animal com um cobertor cirúrgica e / ou usar um cobertor de aquecimento regulados durante a cirurgia.

3. Preparação seringa para injeções intra-oculares

1. Em primeiro lugar, montar o sistema de seringa para a realização das injeções intra-ocular. A 10 mL estanque ao gás RN 1701 Seringa Hamilton é utilizado para a injeção. Remova qualquer agulha ou RN presente porca na extremidade da seringa.
2. Inserir a ponteira PFA no copo PEEK ponteira do encaixe de compressão. Em seguida, insira a instalação completa no final da seringa e vagamente parafuso a porca RN por cima.
3. Insira uma extremidade do tubo PEEK 1 / 16 polegadas para o encaixe de compressão, através da abertura na porca RN. Certifique-se o tubo PEEK está totalmente encaixado. Aperte a porca RN para comprimir a anilha, selando o tubo PEEK.
4. Executar Etapa 3.2 em ambas as extremidades do engate duplo vidro RN. Anexar a extremidade livre do tubo PEEK a uma extremidade do acoplador duplo vidro RN, apertando a porca RN.
5. A micropipeta de vidro puxado formarão a agulha e barril para o sistema de injeção. Use 1,5 milímetros OD tubo de vidro com paredes espessas capilar para fabricar as pipetas de vidro, e inserir a pipeta de vidro na extremidade livre do acoplador duplo vidro RN. Aperte a porca RN para corrigir a pipeta no lugar.
6. A ponta fina de micropipetas de vidro puxado é tipicamente muito pequeno para a realização de injeções intra-oculares. A fim de criar uma ponta de diâmetro adequado, quebrar a ponta da pipeta de vidro sob a orientação visual, usando um microscópio cirúrgico. O fim de um slide fosco espécime de vidro é bem adequado para quebrar a pipeta. Manter a pipeta em um ângulo e esfregue a ponta ao longo da cobertura de vidro para criar uma quebra. Idealmente, a ponta final deve ser ligeiramente chanfrado. Pode demorar algumas tentativas para produzir uma boa dica, para puxar pipetas múltiplas antes de usar.
7. O sistema de injeção é hidráulico. Portanto, a seringa, linker tubulação PEEK, Dual RN acoplador de vidro ea micropipeta de vidro deve ser preenchido com óleo mineral antes de usar. Usando o kit de Priming Hamilton Seringa Co. (PRMKIT), preencher a seringa priming com óleo mineral. Use uma agulha de grande diâmetro para permitir a passagem fácil do óleo viscoso. Substituir a agulha com o 90030 Hamilton agulha que se encaixa dentro do cilindro da seringa Hamilton 10 mL. Em seguida, coloque um septo de borracha ao longo dos 90.030 Hamilton agulha, a fim de proporcionar uma vedação enquanto está a injectar o óleo mineral.
8. Insira o Hamilton 90.030 agulha da seringa priming na parte traseira do cano da seringa Hamilton de 10 L do sistema de injeção. Pressione o septo firmemente contra a extremidade da seringa para criar um selo.
9. Pressione o êmbolo lentamente. Você vai ver a passagem de óleo mineral através dos elementos de vidro do sistema de injeção e, finalmente, encher a pipeta de vidro. Empurre todo o óleo através do sistema de injeção, a fim de remover quaisquer bolhas de ar ao longo do trato. Se a seringa de enchimento é ficar sem óleo mineral, retire a agulha lentamente enquanto constantemente distribuição de óleo para evitar a formação de bolhas de ar. Encher a seringa e injetar priming novamente.
10. Quando todo o sistema é preenchido com óleo mineral e bolha livre, insira o êmbolo da seringa originais Hamilton 10 mL. O êmbolo até o final de seu curso, a fim de remover o óleo mineral adicional do sistema. Limpe o vidro micropipeta limpa e no final da seringa limpa com etanol a 70%.
11. Withdraw o êmbolo da seringa para a marca de 2 mL sobre o barril. O fim da micropipeta de vidro vai encher com ar proporcionando uma zona tampão entre o óleo mineral e do fluido desejado a ser injetado. O barril de pipeta agora pode ser preenchido por colocar o fim da micropipeta na solução desejada e retirar o êmbolo da seringa Hamilton. Não injetar mais de 4-5 mL de solução em um olho de rato adulto.

4. Procedimento de injeção intra-ocular: Focalizando os Retina Globalmente

1. Com o animal anestesiado e fixado no quadro estereotáxico (como descrito na Seção 2), use olho Alcaine cai para topicamente anestesiar a córnea. Abrir as pálpebras com os dedos e coloque uma gota da solução anestésica na superfície da córnea.
2. Injeção necessárias duas pessoas: uma para inserir a pipeta de vidro na câmara vítrea e manter a posição pipeta, e outro para pressionar o êmbolo da seringa que oferece a solução desejada.
3. Sob um microscópio cirúrgico aderência, o vidro eo acoplador micropipeta de vidro duplo RN com os dedos. Espalhe as pálpebras com os dedos de sua mão livre, formando um "V" forma em frente ao local da injeção. Através da aplicação de tração para as pálpebras, o olho será elevado fora da órbita, expondo a superfície posterior atrás do limbo. Criando um "V" shape com os dedos em frente ao local da injeção, um berço é formado para o olho proporcionando estabilidade ao injetar.
4. Introduza cuidadosamente a ponta da micropipeta de vidro através da conjuntiva, em uma área desprovida de vasos sanguíneos, e através da esclera, em um ângulo para baixo. Você deve sentir um "pop" pequeno quando a pipeta penetra na esclera. Inserir a pipeta em um ângulo ligeiramente para baixo reduz a chance de bater a lente ao inserir a agulha.
5. A pessoa que segura a seringa deve agora injetar o 4 mL de solução pressionando o êmbolo até à marca de 2 mL da seringa. A injecção deve demorar cerca de 1-2 segundos no total. Injetar em um ritmo muito lento> 3 segundos reduz a propagação inicial da solução através da câmara vítrea. Você será capaz de ver a solução injetada rubor através da câmara vítrea sob o microscópio, assim, verificar o sucesso do procedimento.
6. Segure a micropipeta constante por aproximadamente 5 segundos e depois retirar-se, na mesma direção que a agulha foi inserida. A conjuntiva flap vai para trás sobre a pequena abertura, ajudando a selar a perfuração escleral.
7. Cubra a superfície da córnea com pomada oftálmica nos olhos (lágrimas Naturale PM), a fim de evitar o ressecamento da córnea durante a recuperação, e devolver o animal para uma gaiola de recuperação.
8. Pós-cirúrgico analgésicos devem ser administrados de acordo com as diretrizes de sua autoridades cuidados com os animais e os animais devem ser cuidadosamente monitorizados após a cirurgia.

5. Segmentação seletivamente células ganglionares da retina do Stump Nervo Óptico

1. Aplicação de marcadores, drogas, plasmídeos, siRNAs ou vetores virais para coto do nervo óptico, após axotomia, diretamente alvos células ganglionares da retina através de transporte retrógrado. Isto é realizado pela primeira execução de uma transecção do nervo óptico de acordo com o "Protocolo Transecção Nervo Óptico" ^22.
2. Existem dois métodos principais para realizar este procedimento: usando gelfoam, ou injeção direta no nervo óptico.
3. O método é semelhante ao gelfoam retrógrada rastreamento, porém ao entregar tratamentos experimentais no nervo óptico que é desejável rótulo de pré-as células ganglionares da retina através da injeção de traçadores retrógrados no colículo superiores 1 semana antes da axotomia. Isto é importante para a célula de rastreamento, porque, em alguns casos traçadores neuronais podem interferir com o transporte retrógrado de substâncias experimentais ou vice-versa.
4. Imediatamente após o nervo ótico for cortado, um pequeno pedaço de gelfoam embebido na solução experimental é colocado sobre o coto do nervo seccionado óptica. O conteúdo orbital são então retornou ao seu local anterior. Quando o olho é retornado para uma posição neutra, é necessário o uso de fórceps para empurrar o pedaço de gelfoam para dentro da órbita, garantindo que ela permaneça sobre a extremidade do nervo óptico.
5. A técnica de injeção é mais eficaz para a entrega de substâncias que devem ter acesso para o citoplasma do axônio, a fim de ser transportado retrogradamente pelo fluxo axoplasmic. Isto inclui siRNAs e plasmídeos, e em alguns casos vetores virais. A seringa Hamilton 50-10 mL é usada para injetar a solução desejada para o nervo óptico seccionado.
6. Aderência lateral do nervo óptico com fina ponta Dumont fórceps. Insira a ponta da agulha no nervo óptico, em paralelo com o nervo, até que o bisel não é mais visível. A agulha inserida será envolto por todos os lados do nervo. A agulha com bisel curto é desejável.
7. Uma vez que o needle é inserido no nervo, aperte delicadamente nas laterais do nervo com a pinça de ponta fina e injetar um quarto da solução enquanto gira a seringa um quarto de volta no sentido horário ou anti-horário.
8. Continue repetindo o passo 5,7 até ter completado uma rotação completa da agulha e injetou todo o conteúdo da seringa. Para melhores resultados injetar um total de 10 mL de solução utilizando uma seringa Hamilton herméticos 10 mL.
9. Retire a ponta da seringa do nervo. Deixar o excesso de líquido injetado que tem refluído do nervo dentro da órbita, pois isso forma uma piscina adicional para absorção pelas extremidades dos axônios.
10. Retorna o conteúdo orbital para sua posição original, fechar a ferida, e permitir que o animal se recuperar.
11. Pós-cirúrgico analgésicos devem ser administrados de acordo com as diretrizes de sua autoridades cuidados com os animais e os animais devem ser cuidadosamente monitorizados após a cirurgia.

6. Resultados representativos:

Injeções intra-oculares-alvo todas as células da retina globalmente, e funcionam bem para as substâncias de entrega para RGCs feridos desde células ganglionares estão localizados na camada mais interna neuronal da retina, ao lado da câmara vítrea. RGCs também pode ser directamente visados ​​mediante a entrega de substâncias para o coto do nervo seccionado óptica. RGCs Fluorogold retrogradamente marcados podem ser direcionados usando peptídeos, drogas, vetores, plasmídeos ou siRNAs do tronco do nervo, como ilustrado na Figura 1. Figura 1A-C demonstra a localização de um peptídeo Cy3 rotulados na somata de RGCs que foram pré-rotulados pela injeção Fluorogold para o colículo superior. Cy3 peptídeos marcados foram injetados no nervo óptico imediatamente após axotomia, ea retina foi fotografada viva, a fim de evitar que os peptídeos de lixiviação do tecido durante a fixação. Figura 1D-F demonstra a localização de Cy3 siRNAs rotulados e traçador retrógrado Fluorogold em RGCs axotomized. Cy3 siRNAs marcados foram injetados no coto do nervo óptico imediatamente após axotomia, ea retina foi fotografada viva.

Figura 1. Micrografias de epifluorescência de RGCs em retinas flatmounted menos 1 dia após a axotomia e injeção de qualquer peptídeos rotulados ou siRNAs no coto do nervo óptico. (A) rotulagem Fluorogold retrógrado em RGCs axotomized postaxotomy em 1 dia (B) Cy3 fluorescência em RGCs seguintes transporte retrógrado de peptídeos marcados, um dia após a axotomia e injeção de peptídeo no nervo óptico. (C) sobreposição de (A) e (B) demonstrando a localização seletiva de Cy3 peptídeos rotulados de RGCs Fluorogold rotulados. (DF) Os corpos celulares dos Fluorogold RGCs rotulada (D) também estão cheias de Cy3 siRNAs rotulada (E) injetado no coto do nervo óptico 24 horas antes, como mostra a sobreposição (F). Barra de escala em AC é 50 mm. Barra de escala no DF é de 20 mM.

Discussion

Transecção do nervo óptico é um modelo altamente reprodutível de apoptose adulto CNS neurônio. As manipulações experimentais demonstraram neste manuscrito permitir o estudo dos mecanismos da apoptose RGC após a lesão.

Injeções intra-oculares são úteis para o direcionamento global da retina. Este procedimento requer alguma prática, pois é fundamental para não ferir a lente com a ponta da pipeta de vidro. Danos lente foi mostrado para causar a liberação de fatores de crescimento, alterando a sobrevivência da célula e regeneração ^{20, 21.} Também é importante para inserir e retirar cuidadosamente o paralelo pipeta de vidro para a direção da ponta. Qualquer força lateral na ponta da pipeta de vidro pode causar um fragmento de vidro para entrar na câmara vítrea danificar a lente ou retina. Com uma pipeta com uma ponta que é muito fina pode não permitir a entrega de soluções viscosas. Além disso, uma ponta extremamente fina não dar feedback tátil quando a esclera é perfurada aumentando a chance de acidentalmente atingir a lente. A lente deve ficar claro e livre de quaisquer marcas de perfuração, quando observadas ao microscópio. Se a lente é danificado, uma catarata, muitas vezes, forma e a lente embaçada e estes resultados experimentais devem ser excluídos.

O sistema de seringa funciona melhor quando não há bolhas de ar ao longo do trato. Ar pode expandir e comprimir diminuindo a capacidade de resposta da retirada ou entrega solução. Se bolhas de ar são visíveis, lave-os com a seringa priming e óleo mineral. O adaptador de vidro duplo RN com acessórios de compressão faz mudar a pipeta eficiente entre os diferentes animais, tratamentos, ou, no caso de uma quebra. Este sistema é robusto e vai durar muitos anos antes da virolas precisam ser substituídos, desde que pipetas são cuidadosamente inseridos.

Diretamente segmentação RGCs injetando o nervo óptico é um procedimento bastante rápido com algumas ressalvas. Se o coto do nervo óptico é muito curta, faz as injeções difícil. Um toco de curto também aumenta a chance de que a agulha irá danificar os vasos da retina, perto da cabeça do nervo óptico, uma vez que é inserida ao nível do bisel. Assim, um coto do nervo óptico de aproximadamente 2 mm de comprimento é desejável quando realizar injeções de nervosas com esta técnica. As injeções funcionam melhor quando o bisel da seringa é completamente fechado dentro do nervo óptico. É preciso ter cuidado para não passar a ponta da agulha através do lado do nervo como isso cria uma região de baixa resistência, permitindo que o líquido para sair do local da injeção diminuindo assim a eficácia da injeção.

Ao trabalhar com potenciais riscos biológicos, tais como partículas de vírus ou células transformadas, é importante seguir as orientações institucionais e procedimentos de segurança.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Stereotaxic Frame	Stoelting Co.
Rat Gas Mask	Stoelting Co.
Anesthesia System	VetEquip	901806
Isoflurane (PrAErrane)	Baxter Internationl Inc.	DIN 02225875
Surgical Microscope	WPI, Zeiss, Leica
Alcaine Eye Drops	Alcon
Tears Naturale P.M.	Alcon
Fine tip Dumont forceps	Fine Science Tools	11252-00
10 μl Hamilton Syringe (1701RN; 26s/2”/2)	Hamilton Co	80030
1/16 inch Compression Fittings	Hamilton Co	55751-01
1/16 inch OD, 0.010 inch ID, PEEK Tubing	Supelco, Sigma-Aldrich	Z226661
Dual RN Glass Coupler	Hamilton Co	55752-01
Mineral Oil Priming Kit: includes syringe, needles, rubber septa	Hamilton Co	PRMKIT