3-D bir molekül yapısı molekül fonksiyonları nasıl eşsiz bir anlayış sağlar. Yakın atomik çözünürlükte yapı tespiti için temel yöntem, X-ışını kristalografisi. Burada, X-ışını kristalografisi yapı tayini için uygun olan herhangi bir makromolekül üç boyutlu kristaller elde etmek için mevcut yöntemler göstermektedir.
Nasıl işlediğini anlaması için biyolojik makromoleküllerin üç boyutlu yapısını kullanarak, modern biyolojinin en önemli alanlarından biridir. Atomik çözünürlükte yapıların durumu derin ve benzersiz bir protein fonksiyonunun anlaşılmasını sağlar ve canlı bir hücrenin iç işleyişini aydınlatmak için yardımcı olur. Bugüne kadar,% 86 Protein Data Bank (rcsb PDB) girişleri makromoleküler yapıları X-ışını kristalografisi kullanılarak belirlenmiştir.
Kristalografik çalışmalar için uygun kristaller elde etmek için, makromolekül (örneğin protein, nükleik asit, protein-protein kompleksi ya da protein, nükleik asit kompleksi) homojenlik arıtılmış olmalıdır, ya da mümkün olduğunca yakın homojenliği için. Hazırlık homojenliği (McPherson, 1999 Bergfors, 1999) yüksek çözünürlüklü metodla kristaller elde edilmesinde önemli bir faktördür.
Kristalizasyon doygunluk makromolekül getiren gerektirir. Bu nedenle, örnek makromolekül (genellikle 2-50 mg / ml) agregasyonu veya yağış neden olmadan, mümkün olan en yüksek konsantrasyon konsantre olmalıdır. Presipite ajan örnek Tanıtımı çözüm büyüyen büyük üç boyutlu kristaller neden olabilir çözüm, protein kristalleri çekirdeklenme teşvik edebilir. Buharı difüzyon ve toplu kristalizasyon: kristaller elde etmek için iki ana teknikleri vardır. Buharı difüzyon, yağışlı ve protein çözümleri bir karışımını içeren bir damla saf Yağışlı bir odaya kapatılır. Damla ve yağışlı ozmolarite (Şekil 1A) eşit oluncaya kadar su buharı sonra açılan yayılır. Denge sağlanana kadar açılan dehidratasyon faz diyagramı ideal kristal çekirdeklenme bölgesi, hem de protein ve yağışlı yavaş bir konsantrasyon neden olur. Yağışlı (Şekil 1B) uygun miktarda protein ile karıştırma protein tarafından doğrudan çekirdeklenme bölgeye getirerek toplu yöntemi dayanıyor. Bu yöntem genellikle, açılan suyun yayılmasını önlemek için bir parafin / mineral yağ karışımı altında yapılır.
Burada yağ altında toplu kristalizasyon ek olarak, damla ve oturma damla asılı buharı difüzyon için deney düzeneği iki türlü gösterecektir.
Bu yazıda, protein kristalizasyon için genel geçerli protokolleri anlatmak ve göstermek. Çok aşamalı bir prosedür bu yana birkaç düşünceler farkında olmak bir ihtiyacı vardır. Buharlaşma nedeniyle açılan kuruma (0.5-2 mcL), çok küçük hacimleri ile çalışırken, büyük bir endişe. Bu nedenle, iyi-kontrollü bir ortamda çalışmak (düşük hava akımı, yüksek nem ve sıkı sıcaklık kontrolü ile) ve açık havaya açılan maruz kalma en aza indiren bir tekniktir benimsemeye tavsiye edilir. …
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma bir Burroughs Wellcome YM Araştırmacı Ödülü ve MD, Yale Üniversitesi'nde Brown-Coxe Doktora Sonrası Araştırma Bursu ile desteklenmiştir.
New Item | ||||
Lysozyme | Sigma-aldrich | L6876-1G | ||
24 well VDX Plate | Hampton research | HR3-142 | ||
24 well Cryschem Plate | Hampton research | HR3-158 | ||
Dow Corning Vacuum Grease | Hampton research | HR3-510 | ||
Siliconized glass circle coverslides | Hampton research | HR3-231 | ||
100% paraffin oil | Hampton research | HR3-411 | ||
1.88 inch wide Crystal Clear Sealing Tape | Hampton research | HR3-511 | ||
96 Well Imp@ct Plate (Microbatch plate) | Hampton research | HR3-098 |