Die 3-D-Struktur eines Moleküls liefert ein einzigartiges Verständnis dafür, wie das Molekül Funktionen. Die wichtigste Methode zur Strukturaufklärung in nahezu atomarer Auflösung ist Röntgenstrukturanalyse. Hier zeigen wir die aktuellen Methoden zur Gewinnung von dreidimensionalen Kristallen von jedem Makromolekül, die sich für die Strukturbestimmung mittels Röntgen-Kristallographie.
Mit der dreidimensionalen Struktur von biologischen Makromolekülen zu folgern, wie sie funktionieren ist eine der wichtigsten Felder der modernen Biologie. Die Verfügbarkeit von atomarer Auflösung Strukturen bietet einen tiefen und einzigartigen Verständnis der Funktion von Proteinen und hilft, das Innenleben der lebenden Zelle zu entschlüsseln. Bis heute sind 86% der Protein Data Bank (RCSB-PDB) Einträge makromolekularen Strukturen, die mit Hilfe der Röntgenkristallographie waren.
Um geeignete Kristalle für kristallographische Untersuchungen, das Makromolekül (zB Protein, Nukleinsäure-, Protein-Protein-Komplex oder Protein-Nukleinsäure-Komplex) muss bis zur Homogenität gereinigt werden, oder so nah wie möglich an Homogenität. Die Homogenität der Zubereitung ist ein wesentlicher Faktor bei der Beschaffung von Kristallen, die eine hohe Auflösung beugen (Bergfors, 1999; McPherson, 1999).
Die Kristallisation erfordert bringen das Makromolekül zu Übersättigung. Die Probe sollte daher auf eine möglichst hohe Konzentration, ohne dass die Aggregation oder Fällung des Makromoleküls (in der Regel 2-50 mg / mL) konzentriert werden. Die Einführung der Probe zu Fällungsmittel kann die Keimbildung von Protein-Kristalle in der Lösung, die in großen dreidimensionalen Kristallen wachsen aus der Lösung führen kann fördern. Es gibt zwei Techniken, um Kristalle zu erhalten: Dampfdiffusion und Batch-Kristallisation. In Dampfdiffusion, ein Tropfen mit einer Mischung von Fällungsmittel und Protein-Lösungen ist in einer Kammer mit reinem Fällungsmittel versiegelt. Wasserdampf diffundiert dann aus der Drop bis die Osmolarität des Tropfens und das Fällungsmittel gleich (Abbildung 1A). Die Dehydratisierung des Tropfens bewirkt eine langsame Konzentration von sowohl Protein und Fällungsmittel, bis das Gleichgewicht erreicht ist, idealerweise in der Kristallkeimbildung Zone des Phasendiagramms. Die Batch-Verfahren beruht auf der bringt das Protein direkt in das Keimbildungszone durch Mischen Protein mit der entsprechenden Menge an Fällungsmittel (Abbildung 1B). Diese Methode ist in der Regel unter einem Paraffin / Mineralöl Mischung auf die Diffusion von Wasser aus dem Tropfen zu verhindern durchgeführt.
Hier zeigen wir Ihnen zwei Arten von experimentellen Aufbaus für die Dampfdiffusion, hängenden Tropfen und Sitzen fallen, zusätzlich zu Batch-Kristallisation unter Öl.
In diesem Artikel beschreiben wir und zeigen allgemein gängigen Protokolle für die Proteinkristallisation. Da es ein mehrstufiges Verfahren gibt es einige Überlegungen muss man sich bewusst sein. Bei der Arbeit mit sehr kleinen Volumina (0.5-2 mL), Trocknung des Tropfens durch Verdunstung ist ein wichtiges Anliegen. Daher empfiehlt es sich, in einer gut kontrollierten Umgebung arbeiten (mit geringen Luftstrom, hohe Luftfeuchtigkeit und genaue Temperatursteuerung) und eine Technik, die Exposition des Tropfens auf die …
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wurde durch ein Burroughs Wellcome Investigator Award für YM und durch eine Brown-Coxe Postdoktoranden-Stipendium an der Yale University zu MD unterstützt.
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