Den 3-dimensionella strukturen av en molekyl ger en unik förståelse för hur molekylen fungerar. Den huvudsakliga metoden för strukturbestämning på nästan atomär upplösning är röntgenkristallografi. Här visar vi de nuvarande metoderna för att erhålla tredimensionella kristallerna av en viss makromolekyl som är lämpliga för strukturbestämning av röntgenkristallografi.
Med hjälp av tredimensionella strukturen av biologiska makromolekyler att dra slutsatser om hur de fungerar är en av de viktigaste områdena av den moderna biologin. Tillgången på atomär upplösning strukturer ger en djup och unik förståelse av proteiners funktion och hjälper till att reda ut det inre arbetet i den levande cellen. Hittills 86% av Protein Data Bank (rcsb-PDB) poster är makromolekulära strukturer som har fastställts med hjälp av röntgenkristallografi.
För att få kristaller som lämpar sig för kristallografiska studier, makromolekyl den (t.ex. protein, nukleinsyra, protein-protein komplex eller protein-nukleinsyra komplex) måste renas till homogenitet, eller så nära som möjligt homogenitet. Homogeniteten av preparatet är en viktig faktor för att erhålla kristaller som DIFFRAKTERAS till hög upplösning (Bergfors, 1999, McPherson, 1999).
Kristallisering kräver föra makromolekyl till övermättnad. Provet bör därför koncentreras till den högsta möjliga koncentration utan att orsaka aggregering eller utfällning av makromolekyl (vanligen 20-50 mg / ml). Introduktion provet utfällningsmedel kan främja kärnbildning av protein kristaller i lösningen, vilket kan resultera i stora tredimensionella kristallerna växa från lösningen. Det finns två huvudsakliga tekniker för att få kristaller: ångdiffusion och batch kristallisering. I ångdiffusion, en droppe innehåller en blandning av fällningsmedel och protein lösningar är förseglat i en kammare med ren fällningsmedel. Vattenånga diffunderar sedan ut ur droppe tills osmolaritet droppen och fällningsmedel är lika (Figur 1A). Den uttorkning av minskningen orsakar en långsam koncentration av både protein och fällningsmedel tills jämvikt uppnås, helst i kristallen kärnbildning zon av fasdiagram. Partiet metod förlitar sig på att få proteinet direkt i kärnbildning zonen genom att blanda protein med lämplig mängd fällningsmedel (Figur 1B). Denna metod utförs vanligtvis under en paraffin / mineralolja blandningen för att förhindra spridningen av vatten ur nedgången.
Här visar vi två typer av experimentuppställning för ångdiffusion, droppe och sitter droppe, förutom parti kristallisation i olja.
I denna artikel kommer vi beskriva och visa allmänt gällande protokoll för protein kristallisering. Eftersom det en multi-steg finns det några faktorer man måste vara medveten om. När du arbetar med mycket små volymer (0,5-2 mikroliter), torkning av nedgången på grund av avdunstning är ett stort problem. Därför rekommenderas det att arbeta i en väl kontrollerad miljö (med lågt luftflöde, hög luftfuktighet och täta temperaturkontroll) och anta en teknik som minimerar exponeringen av nedgången i det fri…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av en Burroughs Wellcome Investigator Award till YM och av en Brown-Coxe postdoktorsstipendium från Yale University till MD.
New Item | ||||
Lysozyme | Sigma-aldrich | L6876-1G | ||
24 well VDX Plate | Hampton research | HR3-142 | ||
24 well Cryschem Plate | Hampton research | HR3-158 | ||
Dow Corning Vacuum Grease | Hampton research | HR3-510 | ||
Siliconized glass circle coverslides | Hampton research | HR3-231 | ||
100% paraffin oil | Hampton research | HR3-411 | ||
1.88 inch wide Crystal Clear Sealing Tape | Hampton research | HR3-511 | ||
96 Well Imp@ct Plate (Microbatch plate) | Hampton research | HR3-098 |