Imprinting is een fenomeen in plant en zoogdier reproductie. DNA-methylatie speelt een belangrijke rol in de mechanismen van imprinting. Isoleren endosperm en het bepalen van methylatie status van de ingeprente genen in<em> Arabidopsis</em> Kan moeilijk zijn. In dit protocol beschrijven we hoe de endosperm isoleren en te bepalen door de methylatie bisulfiet sequencing.
Arabidopsis thaliana is een uitstekend modelorganisme voor het bestuderen van epigenetische mechanismen. Een van de redenen is het verlies-van-functie null mutant van DNA-methyl-levensvatbaar is, en zo een systeem om te bestuderen hoe het verlies van DNA-methylatie in een genoom van invloed op de groei en ontwikkeling. Imprinting verwijst naar de differentiële expressie van de moederlijke en vaderlijke allelen en speelt een belangrijke rol bij de voortplanting ontwikkeling in zowel zoogdieren en planten. DNA-methylatie is van cruciaal belang voor het bepalen van de vraag of de moeders-of vaderskant allelen van een gen ingeprent is uitgedrukt of het zwijgen opgelegd. In bloeiende planten, is er een dubbele bevruchting gebeurtenis in de voortplanting: een zaadcel bevrucht de eicel naar embryo en een tweede zaadcel zekeringen formulier met de centrale cel aanleiding kan geven tot endosperm. Endosperm is het weefsel waar de inprenting voorkomt in planten. MEDEA, een SET-domeinnaam Polycomb groep gen, en FWA, een transcriptiefactor regulerende bloei, zijn de eerste twee genen aangetoond dat bedrukt in endosperm en hun expressie wordt gecontroleerd door DNA-methylering en demethylering in planten. Met het oog op imprinting status van een gen en methylatie patroon in endosperm te bepalen, moeten we in staat zijn om eerst te isoleren endosperm. Omdat zaad is klein in Arabidopsis, blijft het een uitdaging om Arabidopsis endosperm isoleren en de methylatie te onderzoeken. In deze video protocol, rapporteren we hoe een genetische kruis te voeren, om endosperm weefsel te isoleren uit zaden, en naar de methylatiestatus bepalen bisulfiet sequencing.
Het is relatief eenvoudig om embryo's te scheiden van het endosperm en de zaadhuid, maar het is vervelend om endosperm scheiden van zaadhuid, vooral voor zaden in een vroeg of midden-torpedo stadium van de embryogenese. Omdat zaadhuid alleen bij een zeer kleine hoeveelheid weefsel, voor sommige genen, bijvoorbeeld, MEA en de FWA, hoeven we niet te endosperm scheiden van zaadhuid. Dat betekent dat we kunnen isoleren RNA's uit een mengsel van endosperm en zaadhuid weefsels, controleer dan de expr…
The authors have nothing to disclose.
De auteurs danken mevrouw Jennifer M. Lommel en Tara N. Rognan voor het onderhoud van Arabidopsis-planten. Dit werk werd ondersteund door start-up fondsen van Saint Louis University en de National Institutes of Health beurzen 1R15GM086846-01 en 3R15GM086846-01S1 aan W. Xiao.
Supplies
Reagents