Summary
De mogelijkheid om transgenen te produceren voor
Abstract
Het creëren van transgene dieren wordt op grote schaal gebruikt in C. elegans onderzoek met inbegrip van het gebruik van GFP fusie-eiwitten voor de regulering en expressie patroon van de genen van belang of generatie van de tandem affiniteitszuivering (TAP) gelabelde versies van specifieke genen om hun zuivering te vergemakkelijken studie. Typisch transgenen worden gegenereerd door het plaatsen van een promotor stroomopwaarts van een GFP reporter-gen of cDNA van belang, en dit vaak levert een vertegenwoordiger expressiepatroon. Echter, kritische elementen van de genregulatie, zoals de controle-elementen in onvertaald de drie 'regio of alternatieve promotors, kan gemist worden door deze aanpak. Verder slechts een splice variant kan doorgaans worden bestudeerd langs deze weg. In tegenstelling tot het gebruik van de worm genomisch DNA gedragen door fosmid DNA-klonen bevat waarschijnlijk de meeste, zo niet alle elementen die betrokken zijn bij genregulatie in vivo waarin de groter vermogen om de echte uitdrukking patroon en de timing vast te leggen vergunningen. Ter vergemakkelijking van de generatie van transgenen via fosmid DNA, beschrijven we een E. coli op basis van recombineering procedure om GFP, een TAP-tag, of andere sequenties van belang te voegen in elke gewenste locatie in het gen. De procedure maakt gebruik van de galK gen als de selectie marker voor zowel de positieve en negatieve selectie stappen in recombineering wat resulteert in het verkrijgen van de gewenste wijziging met een hoge efficiëntie. Verder, plasmiden die de galK gen geflankeerd door homologie armen tot veelgebruikte GFP en TAP fusie-genen zijn beschikbaar die de kosten van de oligos te verminderen met 50% bij het genereren van een GFP of TAP fusie-eiwit. Deze plasmiden gebruik maken van de R6K replicatieoorsprong die de noodzaak voor uitgebreide PCR product zuivering uitsluit. Tot slot hebben we ook aantonen dat er een techniek om de unc-119 marker te integreren op de fosmid ruggengraat die het mogelijk maakt de fosmid direct worden geïnjecteerd of gebombardeerd in de wormen om transgene dieren te genereren. Deze video toont de procedures die betrokken zijn bij het genereren van een transgen via recombineering met deze methode.
Protocol
Overzicht
Veel transgenen gebruikt bij het genereren van transgene C. elegans bestaan uit promoter sequenties en misschien een gen cDNA gekloneerd in een van de vectoren die door het laboratorium van dr. Andy Fire 1. Hoewel deze transgenen zijn vaak succesvol met betrekking tot het produceren van een GFP reporter-gen of het uitdrukken van een cDNA in een gewenst patroon, kunnen deze transgenen missen de alternatieve promotors, enhancer-elementen, en 3 'onvertaalde gebied (UTR) elementen die een belangrijke rol spelen in de controle van genexpressie in vivo 2. Bijvoorbeeld, zowel de daf-12 en FAH-1 genen hebben belangrijke enhancer elementen die buiten liggen van de proximale promotor die werden gemist in promotor slechts constructies 3,4,5. Verder veel transgene constructies gebruik maken van de UNC-54 3'UTR die de regelgeving voorkomt door de juiste microRNA genen 6,7,8. Bijgevolg zou het genereren van transgenen met een grote segmenten van de worm genomisch DNA is ideaal voor het vastleggen van alle promotors, splice-varianten, en 3 'UTR controle-elementen. Onlangs is een C. elegans fosmid bibliotheek die bestaat uit ~ 40 kb regio's van genomisch DNA en omvat bijna alle van het genoom is gebouwd. Het gebruik van de worm genomisch DNA gedragen door deze fosmid DNA-klonen resultaten in de groter vermogen om de echte uitdrukking patroon en de timing van specifieke genen 2,8,9,10,11 vast te leggen.
Echter, het werken met grote delen van genomisch DNA vormt praktische uitdagingen, zoals de grote problemen bij het gebruik van standaard moleculair-biologische technieken 12. Om deze beperkingen, om technieken te wijzigen fosmids of bacteriële kunstmatige chromosomen via homologe recombinatie in E. coli zijn ontwikkeld en worden genoemd recombineering 12,13. Recombineering maakt het mogelijk naadloos invoegen van GFP, een tandem affiniteitszuivering (TAP)-tag, of andere sequenties van belang in een locatie in het gen gedragen door de C. elegans fosmid kloon 2,10,14. Homologe recombinatie optreedt tussen een PCR-product geflankeerd door 50 bp regio's van homologie met de doelgroep site en het doel-DNA in speciaal gemodificeerde E. coli-stammen.
We hebben onlangs beschreef een procedure in twee fasen voor de aanpassing van C. elegans fosmids door recombineering dat betekent het inbrengen van de galK-gen op de gewenste locatie en plaats dit gen met de gewenste volgorde 2. De galK gen dient als een effectieve selectie marker voor beide stappen in het proces als het kan gekozen worden voor en tegen via het gebruik van selectieve groei medium 15. In de eerste fase van fosmid modificatie, is de galK gen ingebracht via homologe recombinatie op de gewenste locatie, en de juiste wijze aangepast fosmids geïdentificeerd door positieve selectie voor de mogelijkheid om galactose gebruiken als een koolstofbron 2,15. In de tweede fase, is de galK-gen vervangen door de gewenste volgorde, en de juiste aangepaste fosmids worden geïdentificeerd door middel van negatieve selectie tegen de galK-gen door het gebruik van het giftige galactose afgeleide deoxygalactose die galK + 2,15 bacteriën doodt. Een voordeel van de galK is het vermogen van een enkel gen te worden gebruikt voor de positieve en negatieve selectie stappen, in plaats van andere markers die afzonderlijke genen voor elke stap, en de resultaten zijn in het verkrijgen van de gewenste modificatie met hoog rendement 2,15.
Om de toepassing van deze techniek te vergemakkelijken C. elegans onderzoek hebben we een aantal wijzigingen in de beschikbare middelen. Ten eerste, de GFP en TAP labels algemeen worden gebruikt voor het genereren van transgenen worm, dus we gebouwd in 50 bp regio's van homologie met elk van deze tags in de pMOD4 galK-G en pMOD4 galK-GT plasmiden die dienen als de bron van de galK gen 2. Deze regio's laten een enkele set van oligo worden gebruikt voor beide fasen van de fosmid modificatie die de noodzaak om een tweede set iets duurder oligos bestellen bespaart. Ten tweede, deze plasmiden gebruik maken van de R6K replicatieoorsprong die de noodzaak voor de vertering van de ouder plasmide of uitgebreide PCR product zuivering als de ouder-plasmide is niet in staat is te repliceren in de bacteriën die in recombineering uitsluit en kan alleen repliceren in speciale stammen zoals de EC100 2 , 16 (tabel 1 en tabel 2). Ten slotte is een gebruikelijke manier van het genereren van transgene C. elegans is door het gebruik van biolistische bombardement gevolgd door selectie voor transgene wormen via de redding van de unc-119 mutatie 17. Om de fosmids compatibel is met bombardement, ontwikkelden we de pLoxP unc-119 plasmide die gebruikt kunnen worden om de unc-119 marker te integreren op de fosmid backbone 2.
I. Oligo Ontwerp
Met recombineering voor de gewenste sequenties kan worden gestoken op elke locatie binnen het gen. Voorkomende plaatsen zijn op het 5 'uiteinde of 3' einde afhankelijk van de functionele domeinen, splice-varianten, of post-translationele modificaties zoals splitsing door proteases. De pMOD4 GFP plasmide die door ons laboratorium kunnen worden gebruikt om een FLAG-gelabeld GFP invoegen op elk gewenst terrein als het plasmide bevat een initiator codon en mist een 3 'stopcodon (figuur 1). In tegenstelling, de TAP-tag heeft specifieke versies voor 5 'en 3' fusies als gevolg van TEV decollete gebruikt tijdens de zuivering 18,19.
- Plan de plaats van de tag-insertie in het gen. Overweeg alternatieve promotors, functionele domeinen, alternatieve snijden, en de post-translationele modificaties bij het overwegen van het inbrengen site. Verschillende insertieplaatsen kan worden gebruikt om alle, een of enkele isovormen van een specifiek gen tag. Identificeer 50 bp regio stroomopwaarts en stroomafwaarts van het invoegpunt.
- Ontwerp de oligo (tabel 1). Ofwel 100 nM schaal - gel gezuiverd oligo's of Ultramer oligo's van Integrated DNA Technologies kan worden gebruikt voor de procedure.
Voor het uitvoeren van galK recombineering, moet u galK primers ontwerpen met 50 bp homologie met een gebied aan weerszijden van de gewenste site te wijzigen en het 3 'uiteinde van deze primers binden aan de galK cassette, dat aanwezig is in zowel pMOD4 galK-G en pMOD4 galK-GT (figuur 1). De forward oligo wordt 5'------- 50 bp homologie ------- CCTGTTGACAATTAATCATCGGCA-3 'en de achterkant een als-5'------- 50 bp homologie op de complementaire streng - ------ TCAGCACTGTCCTGCTCCT-3 '.
Voor het uitvoeren van galK recombineering met GFP, moet je pMOD4 galK-G of pMOD4 galK-GT primers ontwerp met 50 bp homologie met een gebied aan weerszijden van de gewenste site te wijzigen (zie figuur 1). Zorg ervoor dat het fusie-eiwit te houden in het frame. De ATG kan worden weggegooid indien gewenst. Het 3 'uiteinde van deze primers binden aan de regio's van GFP homologie aan weerszijden van de galK cassette. Opmerking: De eerste en laatste codons van GFP zijn onderstreept om de reading frame te tonen. De forward oligo wordt 5'------- 50 bp homologie ------- ATG GATTACAAGGACGATGACGATAAGATGAG -3 'drie' en de achterkant een 5'------- 50 bp homologie op de complementaire streng ------- CAA AGCTTGTGGGCTTTTGTATAG-3 '
Voor het uitvoeren van galK C-TAP termijn recombineering, moet je pMOD4 galK-GT primers ontwerp met 50 bp homologie met een gebied aan weerszijden van de gewenste site te wijzigen (zie figuur 1). Zorg ervoor dat het fusie-eiwit te houden in het frame. Het 3 'uiteinde van deze primers binden aan de regio's van TAP homologie aan weerszijden van de galK cassette. Opmerking: De eerste en laatste codons van TAP zijn onderstreept om de reading frame te tonen. De forward oligo wordt 5'------- 50 bp homologie ------ ATG GAAAAGAGAAGATGGAAAAAG - -3 'en de achterkant een 5'------- 50 bp homologie op de complementaire streng - ------ GGT TGACTTCCCCGC -3 '
Voor het uitvoeren van galK N-term TAP recombineering, moet je pMOD4 galK-GT primers ontwerp met 50 bp homologie met een gebied aan weerszijden van de gewenste site te wijzigen (zie figuur 1). Zorg ervoor dat het fusie-eiwit te houden in het frame. Het 3 'uiteinde van deze primers binden aan de regio's van TAP homologie aan weerszijden van de galK cassette. Opmerking: De eerste en laatste codons van TAP zijn onderstreept om de reading frame te tonen. De forward oligo wordt 5'------- 50 bp homologie ------ ATG GCAGGCCTTGCGC - -3 'en de achterkant een 5'------- 50 bp homologie op de complementaire streng - ------ AAG TGCCCCGGAGGATGAGATTTTCT -3 ' - Genereer een set van flankerende oligos voor PCR in latere stappen als voor sequencing van het fosmid. Dit zijn standaard PCR oligo's die moeten binden ~ 100 bp stroomopwaarts en stroomafwaarts van de plaats van inbrengen.
II. Overdracht Fosmid naar SW016 bacteriën
De fosmids uit de C. elegans fosmid bibliotheek aanbiedt, zijn in de EPI300 bacteriestam (F-mcrA Δ (MRR-hsdRMS-mcrBC) φ80dlacZΔM15 ΔlacX74 recA1 endA1 araD139 Δ (ara, leu) 7697 Galu galK λ-rpsL nupG trfA tonA) (Epicentre Biotechnologies, Madison, WI ) die het mogelijk maakt de fosmid expressie die moet worden verhoogd tot boven een enkel exemplaar per cel tot DNA-opbrengsten te verbeteren tijdens het zuiveringsproces (tabel 2). Voor recombineering, zal de fosmid moeten worden overgebracht naar de SW106 bacteriestam (mcrA Δ (MRR-hsdRMS-mcrBC) ΔlacX74 deor endA1 araD139 Δ (ara, leu) 7697 rpsL recA1 nupG φ80dlacZΔM15 [λc1857 (cro-BIOA) <> Tet ] (cro-BIOA) <> AraC-PBAD Cre ΔgalK) (NCI-Frederick) stam die de λred homologe recombinatie genen die onder de controle van een temperatuurgevoelige λ repressor en een arabinose induceerbare Cre-recombinase (tabel 2) 15 draagt.
- Om de fosmid kloon van Gene van belang (GOI) vanaf GeneService (Cambridge, Verenigd Koninkrijk) met behulp van Wormbase als een gids. Bij de selectie van klonen, kiezen we voor degenen die de Indiase overheid hebben in het midden van de reeks. Degenen die naburige genen uit te sluiten zou de voorkeur verdienen, maar kan moeilijk te vinden.
- Cultuur van de fosmid kloon van de Indiase overheid in LB met 12,5 microgram / ml chlooramfenicol bij 37 ° C.
- Grow een 1,5 ml overnacht cultuur van de fosmid, en mini-prep de fosmid DNA met behulp van de Epicentre fosmid prep-kit (Epicentre Biotechnologies, Madison, WI). We volgen de alternatieve protocol beschreven in de instructies die het toevoegen van de Riboshredder mix in een eerdere stap.
- Bepaal de fosmid DNA-concentratie met een spectrofotometer.
- Bereid de elektrocompetente SW106 cellen door het kweken van een 5 ml 's nachts de cultuur van de SW106 in een 14 ml snap-cap buis met LB bouillon met 12,5 microgram / ml chlooramfenicol bij 32 ° C.
- Inoculeren 1 mL in 100 ml LB met chlooramfenicol in een 2 L fles. Grow SW106 bacteriën tot een OD 600 0.6-0.8. NIET hitte-shock.
- Pellet door centrifugeren bij 5000xg gedurende 5 minuten, resuspendeer de pellet door zachte vortexen, en voeg 50 ml ijskoude 10% glycerol. Herhaal deze wasstap.
- Pellet de SW106 door centrifugeren en zuig alle, maar ~ 500 pi van elk supernatant
- Resuspendeer de pellets door zachte vortexen. Freeze 100 pi monsters in vloeibare stikstof of op droog ijs, en bewaar bij -80 ° C voor toekomstig gebruik.
- Transformeren de fosmid DNA in elektrocompetente SW106 cellen door electroporating de bacteriën met ~ 50 ng fosmid DNA met behulp van een Eppendorf 2510 electroporator op 1350 volt bij 0,1 cm gat cuvetten.
- Recover bacteriën in 1 ml LB gedurende 1 uur bij 32 ° C.
- Plaat aliquots op LB-platen met chlooramfenicol (12,5 ug / ml) en incubeer bij 32 ° C gedurende de nacht.
- Controleer de aanwezigheid van de Indiase overheid door de kolonie PCR. Grow een 5 ml overnacht cultuur in LB met 12,5 microgram / ml chlooramfenicol bij 32 ° C. Voeg 0,5 ul van cultuur tot een standaard PCR-reactie met de flankerende oligo's, en verhoging van de aanvankelijke 95 ° C incubatie tot 5 minuten voor de bacteriën te lyseren PCR.
- Bereid een glycerol voorraad voor langdurige opslag.
III. Het inbrengen van galK Gene door Recombineering
In de eerste fase van fosmid modificatie, is de galK gen ingebracht in de fosmid door homologe recombinatie, en de juiste aangepaste fosmids worden geselecteerd door groei op minimale media die galactose als enige koolstofbron (Figuur 2A). De SW106 bacteriën groeien langzaam op de minimale media en 3-5 dagen zijn nodig om kolonies te zien.
- Bereid MOPS minimale media platen met 0,2% galactose. MOPS minimale media is verkrijgbaar bij Teknova Inc (Hollister, CA) (catalogus # M2106) maar geen gebruik maken van de meegeleverde glucose.
MOPS minimale media met 0,2% galactose (1 L)
Autoclaaf 15 gram agar-agar in 870 ml water
Afkoelen tot 55 ° C en voeg toe:100 ml 10X MOPS minimale media 5 ml 0,2 mg / ml d-biotine (steriel gefilterd) 4,5 ml 10 mg / ml L-leucine (1%, verwarmd, vervolgens afgekoeld en steriel gefilterd) 10 ml 20% galactose (geautoclaveerd) 1 mL 12,5 mg / ml chlooramfenicol in EtOH 2,55 mL 20% NH 4 Cl 10 ml 0.132 M dibasisch kaliumfosfaat - PCR versterken de pMOD4 galK-G of pMOD4 galK-GT cassettes met behulp van de primers ontworpen hierboven. We hebben gebruik gemaakt Phusion (New England Biolabs, Ipswich, MA) of GoTaq (Promega, Madison, WI).
- Gel zuivert de resulterende band. Kwantificeren van de opbrengst door de gel of Nanodrop spectrofotometer. Dit PCR-product is klaar voor stap 3.14.
- Inoculeren een overnachting cultuur van SW106 cellen met de fosmid DNA in 5 ml LB met chlooramfenicol (12,5 ng / pi). Groeien bij 32 ° C.
- Stel schudwaterbad tot 42 ° C warm-up met een steriele kolf van 250 ml in de houder. Het gebruik van een schudwaterbad is van cruciaal belang voor het verkrijgen van een hoog rendement.
- Voeg 1 ml van de nacht cultuur tot 100 ml van LB en chlooramfenicol in een 2 L fles. Groeien tot een OD 0,6-0,8. Dit duurt meestal 3-4 uur.
- Breng 50 ml van de SW106 cellen aan de kolf van 250 ml en warmte-shock bij 42 ° C gedurende precies 20 minuten. in een waterbad geschud bij 100 tpm Laat de resterende bacteriën bij 32 ° C als de niet-geïnduceerde controle.
- Koel de geïnduceerde en niet-geïnduceerde bacteriën op ijs gedurende 10 minuten.
- Breng de monsters twee steriele centrifugebuizen en pellet op ~ 5000xg gedurende 5 minuten.
- Giet alle bovenstaande vloeistof en resuspendeer de pellet in 1 ml ijskoud 10% glycerol door zachte vortexen (met name de 3-4).
- Bij het opnieuw gesuspendeerd, nog een 49 ml ijskoude 10% glycerol, en pellet de monsters op ~ 5000xg gedurende 5 minuten.
- Herhaalt u stap 3.9, 3.10 en 3.11.
- Verwijder alle supernatant door het omkeren van de buizen, en resuspendeer de pellet in de resterende vloeistof (ongeveer 500 pi elk). Aliquot in 100 il monsters, te bevriezen op droog ijs, en bewaar bij -80 ° C. Deze zijn goed voor weken tot maanden. (Wij meestal hier stoppen en de elektroporatie de volgende dag uit te voeren).
- Electroporate de geïnduceerde en niet-geïnduceerde SW106 cellen met 150 ng van het PCR-product met behulp van 0,1 cm gat cuvetten in een Eppendorf 2510 electroporator vastgesteld op 1.350 volt.
- Terugvordering van de bacteriën in 1 ml LB in een 14 ml Falcon buis. Incubeer bij 32 ° C gedurende 4,5 uur.
- Pellet de bacteriën in een microfuge bij 13.200 rpm gedurende 15 seconden. De bacteriën zijn geresuspendeerd in M9 en vervolgens tweemaal gewassen verwijder rijk medium (zie hieronder voor recept).
- M9 medium (1 L)
- 6g Na 2 HPO 4
- 3g KH 2 PO 4
- 1g NH 4 Cl
- 0.5g NaCl
- AUTOCLAVE
- Na de tweede wasbeurt, wordt het supernatant verwijderd en de pellet wordt geresuspendeerd in 1 ml M9 voor plating seriële verdunningen in M9 (100 pL, 100 ul van een 1:10 verdunning, en 100 ul 1:100) op MOPS minimale media.
- Incubeer 3-5 dagen bij 32 ° C in een incubator. Let op: Wees geduldig als de ware positieven langzaam groeien.
- Streak een paar kolonies op agar MacConkey indicator platen (BD # 281810), aangevuld met 1% galactose en chlooramfenicol 12,5 ug / ml. Alle kolonies verschijnen na de laatste stap moet galK + zijn, maar om zich te ontdoen van elke galK - verontreinigende stoffen, is het belangrijk om enkele, fel roze kolonies te krijgen alvorens de tweede stap. De galK - kolonies worden wit / kleurloos is en de galK + bacteriën worden fel rood / roze als gevolg van een pH-verandering als gevolg van gefermenteerde galactose na een nacht incubatie bij 32 ° C.
- Kies een enkele kolonie en inoculeren een 5 ml LB + chlooramfenicol 's nachts cultuur voor de groei bij 32 ° C.
- Bevestigen dat het inbrengen van de galK-gen op de juiste locatie via PCR met behulp van de flankerende oligos. Voeg 0,5 pi van de cultuur naar een standaard PCR-reactie en verhoging van de aanvankelijke 95 ° C incubatie tot 5 minuten om de bacteriën te lyseren. Het PCR-product moet worden upshifted in grootte als gevolg van de aanwezigheid van het galK gen.
- Bereid een glycerol voorraad voor opslag.
IV. Vervanging van galK met Tag sequenties door Recombineering
In dit stadium is de galK gen wordt vervangen door de gewenste tag sequenties en de juiste wijze aangepaste fosmids worden geselecteerd door selectie tegen de galK gen door de giftige galactose analoge deoxygalactose (DOG) (Figuur 2B).
- Bereid MOPS minimale media platen met 0,2% deoxygalactose (DOG) en 0,2% glycerol. MOPS minimale media is verkrijgbaar bij Teknova Inc (Hollister, CA) (catalogus # M2106) maar geen gebruik maken van de meegeleverde glucose.
MOPS minimale media met 0,2% DOG en glycerol (een L)
Autoclaaf 15 gram agar-agar in 860 ml water
Afkoelen tot 55 ° C en voeg toe:100 ml 10X MOPS minimale media 5 ml 0,2 mg / ml d-biotine (steriel gefilterd) 4,5 ml 10 mg / ml L-leucine (1%, verwarmd, vervolgens afgekoeld en steriel gefilterd) 10 ml 20% deoxygalactose (steriel gefilterd) 10 ml 20% glycerol (geautoclaveerd) 1 mL 12,5 mg / ml chlooramfenicol in EtOH 2,55 mL 20% NH 4 Cl 10 ml 0.132 M dibasisch kaliumfosfaat - PCR versterken de tag fragmenten uit pMOD4 GFP, pBS1761 (N-term TAP), of pBS1479 (C-TAP term) met behulp van dezelfde oligo's die in de eerste ronde of met behulp van GFP korter of TAP-specifieke oligo's (de binnenste sequenties in stap 1.2 ). Als u het maken van meerdere constructies, is het bijzonder nuttig om de kortere oligo's als dezelfde PCR-product kan worden gebruikt voor alle van de constructen te gebruiken.
- Gel zuiveren de PCR-product en meet de concentratie via gel of spectrofotometrie.
- Het genereren van geïnduceerde en niet-geïnduceerde bevoegde SW106 het dragen van de fosmid met de galK gen ingebracht volgende stappen 3.4-3.13 hierboven.
- Electroporate de geïnduceerde en niet-geïnduceerde SW106 cellen met ~ 100 ng van het PCR-product met behulp van 0,1 cm gat cuvetten in een Eppendorf 2510 electroporator vastgesteld op 1.350 volt.
- Herstellen in 1 ml LB in een 14 ml snap-cap tube en incubeer in een 32 ° C schudder gedurende 4,5 uur.
- Wassen en verdun bacteriën zoals in stappen 3,16 en 3,17. Plaat bacteriën op MOPS minimale media platen met 0,2% 2-deoxy-galactose (DOG) en 0,2% glycerol.
- Incubeer bij 32 ° C gedurende drie dagen.
- Vier kolonies worden gebruikt om 5 ml te maken's nachts culturen in LB met 12,5 ug / ml chlooramfenicol. Deze worden gebruikt voor de kolonie PCR, zoals hierboven te bevestigen dat de cassette werd ingebracht. We gebruiken zowel de kortere GFP / TAP specifieke oligo's en de flankerende oligo's om de juiste plaatsen en rechts website te tonen. GFP is ~ 800 bp en TAP is ~ 550 bp terwijl galK is 1,4 kb.
- Bereid een glycerol stock.
V. Toevoeging van unc-119-gen door cre-loxP Recombinatie
Een gangbare manier van het genereren van transgene dieren met de gewijzigde fosmids wordt door het gebruik van biolistische bombardement. Deze techniek maakt gebruik van DNA-gecoate gouddeeltjes aan fosmid DNA te introduceren in C. elegans. Transgene dieren worden meestal geïdentificeerd via redding van de unc-119 mutant met een unc-119 transgen. In deze stap wordt de unc-119-gen toegevoegd aan de fosmid ruggengraat in cis door cre-loxP recombinatie met de pLoxP unc-119 plasmide (figuur 2C).
- Bereid bevoegde SW106 bacteriën het dragen van de aangepaste fosmid uit stap 4.9 met behulp van de stappen 2,5-2,9. GEEN braken bij 42 ° C.
- Electroporate met 50 ng. pLoxP unc-119 van een mini-prep met behulp van 0,1 cm gat cuvetten in een Eppendorf 2510 electroporator vastgesteld op 1.350 volt.
- Recover bacteriën in LB met 0,1% arabinose gedurende 1 uur bij 32 ° C.
- Plaat aliquots op LB-platen met 50μg/mL ampicilline en 12,5 ug / ml chlooramfenicol. Incubeer bij 32 ° C gedurende de nacht. die kiest voor de integratie van pLoxP unc-119 in de fosmid.
- Groei een overnachting cultuur in LB met 50μg/mL ampicilline en 12,5 ug / ml chlooramfenicol. Gebruik 0,5 ul voor PCR te controleren op de aanwezigheid van de unc-119 gen met de unc-119 F (5'-CAAATCCGTGACCTCGACAC-3 ') en unc-119 R (5'-CACAGTTGTTTCTCGAATTTGG-3'), oligo's (tabel 1).
- Maak een glycerol voorraad van de uiteindelijke fosmid.
VI. Large Scale Fosmid Voorbereiding
Ter vergemakkelijking van het verkrijgen van de grotere hoeveelheden fosmid DNA die nodig is voor bombardement, in deze stap de fosmid wordt overgebracht naar de EPI300 bacteriën. Deze stam heeft de mogelijkheid om het fosmid aantal kopieën te verhogen om de opbrengsten te verhogen tijdens de DNA-bereiding.
- Grow een 5 ml 's nachts de cultuur van de bacteriën uit stap 5.5 in LB met ampicilline en chlooramfenicol bij 32 ° C. Gebruik Epicentre fosmid prep-kit om de fosmid isoleren van 1,5 mL van de cultuur.
- Electroporate ~ 50 ng in de EPI300 bacteriën met behulp van 0,1 cm gat cuvetten in een Eppendorf 2510 electroporator vastgesteld op 1.350 volt. De EPI300 bacteriën kunnen worden gekocht bij Epicentre Biotechnologies (Madison, WI).
- Recover bacteriën in LB gedurende 1 uur bij 37 ° C. Plaat aliquots op LB-agar met 50 ug / ml en 12,5 ng / ml chlooramfenicol.
- Groeien en veroorzaken de bacteriën EPI300 met de gewijzigde fosmid behulp van de meegeleverde instructies. Een 50 ml geïnduceerde cultuur geeft> 10 pg gezuiverde fosmid DNA. Zuiveren de fosmid met de Epicentre fosmid prep-kit.
VII. Bombardement
- Gebruik 10 microgram. van fosmid DNA te bombarderen van de DP38 worm stam zoals beschreven (D. Hochbaum, A. Ferguson, en A. Fisher, Jupiter, in press).
VIII. Representatieve resultaten
De wijziging van fosmids via recombineering robuuste en slagingspercentages van> 90% in de negatieve selectie stap worden routinematig waargenomen 2. Dit protocol wordt ook ~ 2 weken in beslag, waardoor de voorbereiding van de transgenen vrij snel. Het protocol is ook geprobeerd door andere laboratoria met succes 20.
| Oligo | Volgorde |
| C-TAP term F | ATGGAAAAGAGAAGATGGAAAAAG |
| C-TAP term R | GGTTGACTTCCCCGC |
| FLAG-GFP F | ATGGATTACAAGGACGATGACGATAAGATGAG |
| FLAG-GFP R | CAAAGCTTGTGGGCTTTTGTATAG |
| N-term TAP F | ATGGCAGGCCTTGCGC |
| N-term TAP R | AAGTGCCCCGGAGGATGAGATTTTCT |
| galK F | CCTGTTGACAATTAATCATCGGCA |
| galK R | TCAGCACTGTCCTGCTCCT |
| unc-119 F | CAAATCCGTGACCTCGACAC |
| unc-119 R | CACAGTTGTTTCTCGAATTTGG |
Tabel 1. Oligonucleotiden gebruikt voor PCR.
| Plasmids | Bron | Beschikbaar op |
| Fosmid kloon | Geneservice Ltd | Geneservice |
| pGalK | 15 | NCI-Frederick |
| pMOD4-RT-G | 2 | Addgene |
| pMOD4-galK-G | ||
| pMOD4-galK-GT | ||
| pLoxP-unc-119 | ||
| pMOD4-GFP | ||
| Bacterie | ||
| SW106 | 15 | NCI-Frederick |
| EPI300 | Epicentrum Biotechnologie | Epicentrum |
| EC100D pir-116 | ||
Tabel 2. Strain en vector beschikbaarheid.
Figuur 1.
Schema van pMOD4-galK-G, en pMOD4-galK-GT, pMOD4 GFP, pLoxP-unc-119
De pMOD4-galk-G plasmide bestaat uit de galK cassette (zwart) geflankeerd door 50 nucleotide regio's identiek aan de 5 'en 3' einden van FLAG (Brown)-GFP (groen), terwijl PMOD 4-galK-GT bestaat uit de galK cassette geflankeerd door zowel de FLAG-GFP homologie regio's en 50 nucleotide regio's identiek aan de 5 'en 3' einden van N-terminale en C-terminale TAP (blauw en oranje, respectievelijk). pMOD4-FLAG-GFP bestaat uit de volledige GFP cassette met een 5 'FLAG-tag en pLoxP unc-119 bestaat uit de unc-119 genomische sequentie (paars) in een plasmide dat een loxP site. Alle plasmiden maken gebruik van de R6K-based pMOD4 (rood) backbone, die niet in staat is om te repliceren in SW106.
Figuur 2.
Overzicht van de galK recombineering proces
Figuur 2A-2C afzonderlijke cijfers tonen de stappen en de tijd die betrokken zijn bij het gebruik van de recombineering galK cassette. Dit zijn dezelfde figuren die zijn samengevoegd in figuur 2d, maar afzonderlijk verstrekt voor de duidelijkheid en het gemak van het lezen. Een fosmid van belang is in de eerste gewijzigd in een twee-staps procedure met betrekking tot het inbrengen van de cassette galK geflankeerd door 50 bp regio's van homologie aan FLAG-GFP of TAP (Figuur 2A), gevolgd door vervanging van deze cassette door de FLAG-GFP of TAP ( Figuur 2B). Later werden de unc-119 marker voor gebruik bij het genereren van transgene dieren wordt in de loxP plaats op de fosmid backbone (figuur 2C).
Figuur 2D toont een samengevoegde bedrag van galK recombineering procedure.
Overzicht van galK recombineering procedure zoals beschreven in de hierboven inclusief de tijd die nodig is voor elke stap van de fusie figuur 2A-2C.
Figuur 2a. De galk invoeging in galk recombineering.
Figuur 2b. De TAG (GFP / TAP) opname in galk recombineering.
Figuur 2c. De toevoeging van unc-119.
Figuur 2d. De gefuseerde overzicht van de galk recombineering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De generatie van transgenen uit fosmids biedt het voordeel van behoud van alle van de inheemse promoter elementen, splice-varianten, en 3 'UTR regulerende elementen. Dit kan leiden tot de bouw van een transgen dat is meer een weerspiegeling van de inheemse expressie patroon, of de bouw van een functioneel transgen als andere benaderingen 5 falen. De resulterende transgenen kan dragen een groot aantal epitoop labels waaronder GFP of een TAP tag.
De bouw van transgenen in drie stappen die allemaal worden uitgevoerd in de SW106 bacteriële vlek 15. Eerst wordt de galK gen geïntegreerd in de gewenste site in de fosmid te wijzigen door middel van recombineering met een PCR-product met galK geflankeerd door homologie armen complementair aan het doel fosmid. Een verbetering ontwikkelden we is de integratie van homologie regio's voor zowel FLAG-GFP of een TAP tag in de galK cassette waardoor een enkele set van oligo te worden gebruikt voor de eerste en tweede stap van de fosmid wijziging en het verlagen van de kosten van oligos. Een verdere vereenvoudiging is het gebruik van een R6K-gebaseerde vector, die niet in staat is om te repliceren op de SW106 bacteriestam en elimineert de noodzaak om de ouder vector verteren. Ten tweede is de galK cassette vervangen met tags zoals GFP of TAP, die worden vervolgens gefuseerd met het gen van de rente op de fosmid. Deze stap is zeer robuust en veel goed aangepast fosmids worden routinematig verkregen. Ten slotte wordt de unc-119 selecteerbare merker voor het genereren van transgene wormen toegevoegd aan de fosmid. Dit creëert een marker in cis en direct gekoppeld aan de gewijzigde fosmid. De UNC-119 selecteerbare merker wordt op grote schaal en compatibel met zowel micro-injectie en biolistische bombardement 17,21. Bombardement is vooral nuttig als grote aantallen transgene lijnen kan worden gegenereerd door een proces en zelfs onervaren personeel kan creëren transgene dieren.
Een belangrijk aspect van dit protocol is het gebruik van een schudwaterbad incubator voor de heat shock stappen tijdens de voorbereiding van de SW106 competente cellen. We vonden dat het gebruik van een lucht-incubator was niet in staat om de bacteriecultuur verwarmen tot 42 ° C, zelfs na 30 minuten in de shaker (niet afgebeeld). We hebben ook geprobeerd de bacteriën onder te dompelen in een waterbad met een suboptimale resultaten (niet getoond). Een schudwaterbad kan worden gekocht gebruikt van een aantal bedrijven indien niet reeds beschikbaar zijn in het lab.
Voorbij het inbrengen van GFP of epitoop tags, zijn we ook begonnen met deze techniek te gebruiken voor site-specifieke mutagenese van de worm genen uitgeoefend fosmids (A. Ferguson en A. Fisher, ongepubliceerd). Dit werd bereikt door het gebruik van een enkelstrengs oligo met de verandering geflankeerd door 50 bp stroomopwaarts en stroomafwaarts van de site om de galK gen te vervangen. De combinatie van fosmid mutagenese in combinatie met het gebruik van een gen knockout mutant kan leiden tot de in vivo functie van bepaald gen isovormen, domeinen, of specifieke aminozuren worden bepaald. Verdere ons protocol verwijdert de galK marker op het einde dus het is mogelijk om extra rondes van de wijziging om extra epitoop tags in te voegen of het uitvoeren van mutagenese op een gelabeld te bouwen.
Tot slot, is het waarschijnlijk dat sommige van deze reagentia kunnen worden gebruikt in de bouw van aangepaste BAC of fosmids door laboratoria niet met wormen. De pMOD4 galK-G en pMOD4 galK-GT genen hebben nog steeds de hele galK gen, zodat eerder gepubliceerde oligo nog steeds kan worden gebruikt om de galK-gen 15 versterken. Dit zal nog steeds de voordelen van het gebruik van de R6K oorsprong van replicatie met betrekking tot niet te hoeven de ouders plasmide verteren of zorgvuldig zuiveren het PCR-product.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
De auteurs willen graag Lindsey Nash bedanken voor hun hulp met het ontwikkelen van de techniek. Dit werk werd gefinancierd door NIH subsidie AG028977 om ALF, een pilot project subsidie van de universiteit van Pittsburgh OAIC (AG024827), en het zaad fondsen van de universiteit van Pittsburgh.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FosmidMAX kit | Epicentre Biotechnologies | FMAX046 | |
| GoTaq | Promega Corp. | M7122 | |
| MOPS Media | TEKnova, Inc. | M2120 | |
| 0.132 M Potassium phosphate solution | TEKnova, Inc. | M2102 | |
| D-galactose | Sigma-Aldrich | G0750 | |
| 2-deoxygalactose | Sigma-Aldrich | D4407 | |
| Biotin | Sigma-Aldrich | B4639 | |
| Leucine | Sigma-Aldrich | L8000 | |
| NH4Cl | Sigma-Aldrich | A9434 | |
| Phusion DNA polymerase | New England Biolabs | F-530S | |
| MacConkey agar base | BD Biosciences | 281810 | |
| Arabinose | Sigma-Aldrich | A3131 | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C1919 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | S5136 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G2025 | |
| Bacto Agar | BD Biosciences | 214010 |
References
- Mello, C., Fire, A.
- Zhang, Y., Nash, L., Fisher, A. L. A simplified, robust, and streamlined procedure for the production of C. elegans transgenes via recombineering. BMC Dev Biol. 8, 119-119 (2008).
- Antebi, A., Yeh, W. H., Tait, D., Hedgecock, E. M., Riddle, D. L. daf-12 encodes a nuclear receptor that regulates the dauer diapause and developmental age in C. elegans. Genes and Development. 14, 1512-1527 (2000).
- Snow, M. I., Larsen, P. L. Structure and expression of daf-12: a nuclear hormone receptor with three isoforms that are involved in development and aging in Caenorhabditis elegans. Biochim. Biophys. Acta. 1494, 104-116 (2000).
- Fisher, A. L., Page, K. E., Lithgow, G. J., Nash, L. The Caenorhabditis elegans K10C2.4 Gene Encodes a Member of the Fumarylacetoacetate Hydrolase Family. A CAENORHABDITIS ELEGANS MODEL OF TYPE I TYROSINEMIA. J Biol.Chem. 283, 9127-9135 (2008).
- Wightman, B., Ha, I., Ruvkun, G. Posttranscriptional regulation of the heterochronic gene lin-14 by lin-4 mediates temporal pattern formation in C. elegans. Cell. 75, 855-862 (1993).
- Lehrbach, N. J. LIN-28 and the poly(U) polymerase PUP-2 regulate let-7 microRNA processing in Caenorhabditis elegans. Nat Struct Mol Biol. 16, 1016-1020 (2009).
- Tursun, B., Cochella, L., Carrera, I., Hobert, O. A toolkit and robust pipeline for the generation of fosmid-based reporter genes in C. elegans. PLoS One. 4, e4625-e4625 (2009).
- Bamps, S., Hope, I. A. Large-scale gene expression pattern analysis, in situ, in Caenorhabditis elegans. Brief. Funct. Genomic. Proteomic. , (2008).
- Dolphin, C. T., Hope, I. A. Caenorhabditis elegans reporter fusion genes generated by seamless modification of large genomic DNA clones. Nucleic Acids Res. 34, e72-e72 (2006).
- Sarov, M. A recombineering pipeline for functional genomics applied to Caenorhabditis elegans. Nat. Methods. 3, 839-844 (2006).
- Yang, X. W., Model, P., Heintz, N. Homologous recombination based modification in Escherichia coli and germline transmission in transgenic mice of a bacterial artificial chromosome. Nat Biotechnol. 15, 859-865 (1997).
- Court, D. L., Sawitzke, J. A., Thomason, L. C. Genetic engineering using homologous recombination. Annu.Rev.Genet. 36, 361-388 (2002).
- Westenberg, M., Bamps, S., Soedling, H., Hope, I. A., Dolphin, C. T. Escherichia coli MW005: lambda Red-mediated recombineering and copy-number induction of oriV-equipped constructs in a single host. BMC Biotechnol. 10, 27-27 (2010).
- Warming, S., Costantino, N., Court, D. L., Jenkins, N. A., Copeland, N. G. Simple and highly efficient BAC recombineering using galK selection. Nucleic Acids Res. 33, e36-e36 (2005).
- Penfold, R. J., Pemberton, J. M. An improved suicide vector for construction of chromosomal insertion mutations in bacteria. Gene. 118, 145-146 (1992).
- Praitis, V., Casey, E., Collar, D., Austin, J. Creation of low-copy integrated transgenic lines in Caenorhabditis elegans. Genetics. 157, 1217-1226 (2001).
- Puig, O. The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification. Methods. 24, 218-229 (2001).
- Rigaut, G. A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration. Nat.Biotechnol. 17, 1030-1032 (1999).
- Achilleos, A., Wehman, A. M., Nance, J. PAR-3 mediates the initial clustering and apical localization of junction and polarity proteins during C. elegans intestinal epithelial cell polarization. Development. 137, 1833-1842 (2010).
- Maduro, M., Pilgrim, D. Identification and cloning of unc-119, a gene expressed in the Caenorhabditis elegans nervous system. Genetics. 141, 977-988 (1995).
