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Biology

का उत्पादन सी. एलिगेंस Recombineering के साथ के माध्यम से transgenes GalK चयन मार्कर

Published: January 11, 2011 doi: 10.3791/2331
Automatic Translation
*1, *2, 2, 2
1Department of Radiation Oncology, Beth Israel Deaconess Medical Center, Harvard Medical School, 2Department of Medicine, Division of Geriatric Medicine and Pittsburgh Institute for Neurodegenerative Diseases, University of Pittsburgh
* These authors contributed equally

Summary

के लिए transgenes उत्पादन करने की क्षमता

Abstract

ट्रांसजेनिक जानवर के निर्माण सी. में व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है एलिगेंस अनुसंधान सहित GFP संलयन प्रोटीन का उपयोग करने के विनियमन और ब्याज या अग्रानुक्रम आत्मीयता शुद्धि की पीढ़ी (नल) विशिष्ट जीन की संस्करण उनके शुद्धीकरण की सुविधा के लिए टैग के जीन की अभिव्यक्ति पैटर्न का अध्ययन . आमतौर पर transgenes एक प्रमोटर एक GFP रिपोर्टर जीन या ब्याज की सीडीएनए के ऊपर रखकर उत्पन्न कर रहे हैं, और इस बार एक प्रतिनिधि अभिव्यक्ति पैटर्न का उत्पादन. हालांकि, 3 'untranslated क्षेत्र या वैकल्पिक प्रमोटरों में नियंत्रण तत्व के रूप में जीन विनियमन के महत्वपूर्ण तत्व, इस दृष्टिकोण से याद किया जा सकता है. इसके अलावा केवल एक एकल ब्याह संस्करण आम तौर पर इस तरह से अध्ययन किया जा सकता है. इसके विपरीत, fosmid डीएनए क्लोन द्वारा किए कीड़ा जीनोमिक डीएनए के उपयोग की संभावना शामिल सबसे जो अधिक से अधिक वास्तविक अभिव्यक्ति पैटर्न और समय पर कब्जा करने की क्षमता परमिट vivo में जीन विनियमन में शामिल सभी तत्वों अगर नहीं. Fosmid डीएनए का उपयोग कर transgenes की पीढ़ी की सुविधा के लिए, हम एक ई. वर्णन कोलाई recombineering GFP, एक नल टैग, या हित के अन्य दृश्यों जीन में किसी भी स्थान में सम्मिलित प्रक्रिया आधारित है. प्रक्रिया चयन मार्कर के रूप में सकारात्मक और नकारात्मक दोनों recombineering में चयन कदम है जो उच्च दक्षता के साथ वांछित संशोधन को प्राप्त करने में परिणाम के लिए galK जीन का उपयोग करता है. इसके अलावा, galK GFP के लिए आमतौर पर इस्तेमाल किया अनुरूपता हथियार द्वारा flanked और जीन नल संलयन जीन युक्त plasmids उपलब्ध है जो 50% से oligos की लागत को कम जब एक GFP या नल संलयन प्रोटीन पैदा कर रहे हैं. ये प्लास्मिड जो व्यापक पीसीआर उत्पाद शुद्धि के लिए जरूरत precludes R6K प्रतिकृति मूल का उपयोग करें. अंत में, हम भी fosmid रीढ़ जो fosmid सीधे इंजेक्शन या कीड़े में बमबारी ट्रांसजेनिक जानवर उत्पन्न की अनुमति देता है पर unc-119 मार्कर को एकीकृत करने के लिए एक तकनीक का प्रदर्शन. यह वीडियो recombineering के माध्यम से इस पद्धति का उपयोग करके एक transgene पैदा करने में शामिल प्रक्रियाओं को दर्शाता है.

Protocol

अवलोकन

कई ट्रांसजेनिक सी. की पीढ़ी में इस्तेमाल किया transgenes एलिगेंस प्रमोटर दृश्यों से मिलकर बनता है और शायद एक सीडीएनए जीन डॉ. एंडी 1 आग की प्रयोगशाला द्वारा उत्पन्न वैक्टर में क्लोन. जबकि इन transgenes अक्सर एक GFP रिपोर्टर जीन उत्पादन या एक वांछित पैटर्न में एक सीडीएनए व्यक्त करने का संबंध है के साथ सफल रहे हैं, इन transgenes वैकल्पिक प्रमोटरों, बढ़ाने के तत्वों, और 3 'untranslated क्षेत्र (UTR) तत्व है जो नियंत्रण में महत्वपूर्ण भूमिका निभाने की कमी कर सकते हैं 2 vivo में जीन की अभिव्यक्ति की. उदाहरण के लिए, दोनों daf-12 और फाह-1 जीन महत्वपूर्ण बढ़ाने तत्व है जो प्रॉक्सिमल प्रमोटर जो प्रमोटर में चूक गए थे केवल 3,4,5 constructs के बाहर झूठ है . इसके अलावा कई transgene constructs unc-54 3'UTR जो उचित microRNA जीन 6,7,8 द्वारा विनियमन रोकता का उपयोग करें. नतीजतन, कृमि जीनोमिक डीएनए के बड़े क्षेत्रों के साथ transgenes पैदा प्रमोटरों, ब्याह वेरिएंट, और 3 'UTR नियंत्रण तत्वों के सभी पर कब्जा करने के लिए आदर्श होगा. हाल ही में एक सी. एलिगेंस fosmid पुस्तकालय जो ~ 40 केबी क्षेत्रों जीनोमिक डीएनए के होते हैं और जीनोम के लगभग सभी कवर का निर्माण किया गया है. कृमि जीनोमिक डीएनए का उपयोग अधिक से अधिक वास्तविक अभिव्यक्ति पैटर्न और विशिष्ट 2,8,9,10,11 जीन के समय पर कब्जा करने की क्षमता में इन fosmid डीएनए क्लोन परिणाम द्वारा किया जाता है.

हालांकि, जीनोमिक डीएनए के बड़े क्षेत्रों के साथ काम कर मानक आण्विक जीव विज्ञान तकनीक 12 का प्रयोग करने में बड़ी कठिनाइयों के रूप में व्यावहारिक चुनौतियों poses. इन सीमाओं को पार करने के लिए, तकनीक ई. में मुताबिक़ पुनर्संयोजन के माध्यम से fosmids या जीवाणु कृत्रिम क्रोमोसोम को संशोधित करने के लिए कोलाई विकसित किया गया है और 12,13 recombineering करार दिया है . Recombineering सी. द्वारा किए गए जीन में किसी भी स्थान में GFP, एक अग्रानुक्रम आत्मीयता शुद्धि - टैग (नल), या हित के अन्य दृश्यों के निर्बाध सम्मिलन की अनुमति देता है एलिगेंस fosmid 2,10,14 क्लोन. मुताबिक़ पुनर्संयोजन ई. में विशेष रूप से संशोधित लक्ष्य साइट और लक्ष्य डीएनए समरूपता के 50 बीपी क्षेत्रों द्वारा flanked एक पीसीआर उत्पाद के बीच होता है कोलाई उपभेदों.

हम हाल ही में सी. के संशोधन के लिए दो चरण एक प्रक्रिया का वर्णन recombineering जो वांछित स्थान पर galK जीन डालने और फिर वांछित दो अनुक्रम के साथ इस जीन की जगह शामिल द्वारा एलिगेंस fosmids. galK जीन प्रक्रिया में दोनों चरणों के लिए एक प्रभावी चयन मार्कर के रूप में इसे के लिए और के खिलाफ चयनात्मक विकास मध्यम 15 के उपयोग के माध्यम से चुना जा सकता है के रूप में कार्य करता है. Fosmid संशोधन के पहले चरण में, galK जीन मुताबिक़ पुनर्संयोजन के माध्यम से वांछित स्थान पर डाला है, और सही ढंग से संशोधित fosmids एक कार्बन 2,15 स्रोत के रूप में galactose का उपयोग करने की क्षमता के लिए सकारात्मक चयन के द्वारा की पहचान की. दूसरे चरण में, galK जीन वांछित अनुक्रम द्वारा प्रतिस्थापित किया गया है, और सही ढंग से संशोधित fosmids विषाक्त galactose व्युत्पन्न deoxygalactose जो galK + 2,15 जीवाणुओं को मारता है के उपयोग के माध्यम से galK जीन के खिलाफ नकारात्मक चयन के माध्यम से की पहचान कर रहे हैं. GalK की एक लाभ के बजाय अन्य मार्कर है जो उच्च दक्षता 2,15 के साथ वांछित संशोधन प्राप्त करने में हर कदम के लिए अलग जीन, और परिणाम है, एक एकल जीन की सकारात्मक और नकारात्मक चयन चरणों के लिए इस्तेमाल किया जा करने की क्षमता है.

सी. करने के लिए इस तकनीक का आवेदन की सुविधा एलिगेंस अनुसंधान, हम उपलब्ध संसाधनों के लिए कई परिवर्तन किए . सबसे पहले, GFP और नल टैग आमतौर कीड़ा transgenes उत्पन्न करने के लिए उपयोग किया जाता है, तो हम समरूपता के 50 बीपी क्षेत्रों में pMOD4 galK जी और galK जी.टी. pMOD4 plasmids जो galK जीन के स्रोत के रूप में सेवा में इन टैग के प्रत्येक के लिए बनाया 2. इन क्षेत्रों fosmid संशोधन है जो कुछ हद तक महंगा oligos के एक दूसरे सेट के आदेश की जरूरत बचाता है की दोनों चरणों के लिए इस्तेमाल किया जा oligos के एक सेट की अनुमति देते हैं. दूसरा, इन plasmids R6K प्रतिकृति मूल है जो माता पिता प्लाज्मिड या व्यापक पीसीआर उत्पाद शुद्धि पचाने प्लाज्मिड माता पिता के रूप में recombineering के लिए इस्तेमाल किया बैक्टीरिया में दोहराने में सक्षम नहीं है के लिए की जरूरत precludes उपयोग करते हैं, और केवल 2 EC100 जैसे विशेष उपभेदों में नकल कर सकते हैं , 16 (1 तालिका और तालिका 2). अंत में, ट्रांसजेनिक सी. पैदा करने का एक आम तरीका एलिगेंस biolistic unc-119 17 उत्परिवर्तन के बचाव के माध्यम से ट्रांसजेनिक कीड़े के लिए चयन के बाद बमबारी के उपयोग के माध्यम से है. Fosmids बमबारी के साथ संगत बनाने के लिए, हम pLoxP unc 119 प्लाज्मिड जो fosmid 2 रीढ़ की हड्डी पर unc-119 मार्कर को एकीकृत करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है विकसित की है.

I. oligo डिजाइन

Recombineering के साथ वांछित दृश्यों जीन के भीतर किसी भी साइट पर डाला जा सकता है है. आम साइटों 5 'अंत या 3' कार्यात्मक डोमेन, ब्याह वेरिएंट, या proteases द्वारा बाद translational दरार के रूप में ऐसे संशोधनों के आधार पर अंत में कर रहे हैं. pMOD4 प्लाज्मिड GFP हमारी प्रयोगशाला के द्वारा बनाई गई किसी भी साइट पर एक झंडा टैग GFP सम्मिलित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है के रूप में प्लाज्मिड एक आरंभकर्ता codon शामिल है और एक 'तीन रोक codon (चित्रा 1) का अभाव है. इसके विपरीत, नल टैग 5 'और 3' TEV 18,19 शुद्धि के दौरान इस्तेमाल किया दरार के कारण fusions के लिए विशिष्ट संस्करण है .

  1. जीन के भीतर योजना टैग सम्मिलन की साइट. वैकल्पिक प्रमोटरों, कार्यात्मक डोमेन, टुकड़ा करने की क्रिया वैकल्पिक, और बाद translational संशोधनों पर विचार करें जब सम्मिलन साइट पर विचार. विभिन्न सम्मिलन साइटों के लिए सभी, एक, या एक विशेष जीन के कुछ isoforms टैग करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. 50 सम्मिलन बिंदु के बीपी अपस्ट्रीम और डाउनस्ट्रीम क्षेत्रों को पहचानें.
  2. Oligos (तालिका 1) डिजाइन. - या तो 100 एनएम पैमाने जेल शुद्ध या एकीकृत डीएनए टेक्नोलॉजीज से oligos Ultramer oligos प्रक्रिया के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

    GalK recombineering प्रदर्शन करने के लिए, आप 50 बीपी समरूपता के साथ galK प्राइमरों एक वांछित को संशोधित किया जा साइट और इन प्राइमरों के 3 'अंत flanking क्षेत्र के लिए डिजाइन की जरूरत है galK कैसेट, जो दोनों pMOD4 galK जी और pMOD4 में मौजूद है करने के लिए बाध्य galK जी.टी. (चित्रा 1). आगे oligo 5'------- 50 बीपी अनुरूपता होगा ------- 'CCTGTTGACAATTAATCATCGGCA-3 और 5'------- पूरक भूग्रस्त पर 50 बीपी समरूपता के रूप में रिवर्स - 'TCAGCACTGTCCTGCTCCT-3 ------.

    GFP साथ galK recombineering प्रदर्शन करने के लिए, आप 50 बीपी समरूपता के साथ pMOD4 galK जी या pMOD4 galK जी.टी. प्राइमरों एक वांछित साइट (चित्रा 1) संशोधित किया जा flanking क्षेत्र के लिए डिजाइन की जरूरत है. फ्रेम में संलयन प्रोटीन रखना सुनिश्चित करें. ATG अगर वांछित खारिज किया जा सकता है. इन प्राइमरों के 3 'अंत galK कैसेट flanking GFP समरूपता के क्षेत्रों के लिए बाध्य हैं . नोट: GFP की पहली और आखिरी codons पढ़ने फ्रेम प्रदर्शित करने के लिए रेखांकित कर रहे हैं. आगे oligo 5'------- 50 बीपी अनुरूपता होगा ------- पर पूरक -3 '3' और रिवर्स एक 5'------- 50 बीपी अनुरूपता GATTACAAGGACGATGACGATAAGATGAG ATG कतरा ------- CAA AGCTTGTGGGCTTTTGTATAG-3 '

    GalK सी अवधि नल recombineering प्रदर्शन करने के लिए, आप 50 बीपी समरूपता के साथ pMOD4 galK जी.टी. प्राइमरों एक वांछित साइट (चित्रा 1) संशोधित किया जा flanking क्षेत्र के लिए डिजाइन की जरूरत है. फ्रेम में संलयन प्रोटीन रखना सुनिश्चित करें. इन प्राइमरों के 3 'अंत galK कैसेट flanking नल समरूपता के क्षेत्रों के लिए बाध्य हैं . नोट: नल की पहली और आखिरी codons पढ़ने फ्रेम प्रदर्शित करने के लिए रेखांकित कर रहे हैं. आगे oligo 5'------- 50 बीपी अनुरूपता जाएगा ------ ATG GAAAAGAGAAGATGGAAAAAG -3 'और रिवर्स - एक ------- 5'पूरक भूग्रस्त पर 50 बीपी अनुरूपता ------ GGT TGACTTCCCCGC -3 '

    GalK एन अवधि नल recombineering प्रदर्शन करने के लिए, आप 50 बीपी समरूपता के साथ pMOD4 galK जी.टी. प्राइमरों एक वांछित साइट (चित्रा 1) संशोधित किया जा flanking क्षेत्र के लिए डिजाइन की जरूरत है. फ्रेम में संलयन प्रोटीन रखना सुनिश्चित करें. इन प्राइमरों के 3 'अंत galK कैसेट flanking नल समरूपता के क्षेत्रों के लिए बाध्य हैं . नोट: नल की पहली और आखिरी codons पढ़ने फ्रेम प्रदर्शित करने के लिए रेखांकित कर रहे हैं. आगे oligo 5'------- 50 बीपी अनुरूपता जाएगा ------ ATG GCAGGCCTTGCGC -3 'और रिवर्स - एक ------- 5'पूरक भूग्रस्त पर 50 बीपी अनुरूपता ------ आग TGCCCCGGAGGATGAGATTTTCT -3 '

  3. बाद के चरणों में के रूप में के रूप में अच्छी तरह से fosmid के अनुक्रमण के लिए पीसीआर के लिए oligos flanking का एक सेट उत्पन्न करता है. ये मानक पीसीआर oligos जो ~ 100 बीपी अपस्ट्रीम और सम्मिलन साइट के बहाव के बाँध चाहिए रहे हैं.

द्वितीय. स्थानांतरण SW016 जीवाणु Fosmid

सी. से fosmids एलिगेंस fosmid पुस्तकालय EPI300 बैक्टीरियल तनाव (एफ mcrA Δ (mrr hsdRMS - mcrBC) φ80dlacZΔM15 ΔlacX74 recA1 endA1 araD139 (आरा, लियू) Δ 7697 galU galK λ rpsL nupG trfA tonA) (Epicentre जैव प्रौद्योगिकी, मैडिसन, WI में प्रदान की जाती हैं ) जो fosmid अभिव्यक्ति सेल प्रति एक प्रतिलिपि करने के लिए शुद्धि (तालिका 2) के दौरान डीएनए पैदावार में सुधार के ऊपर वृद्धि हुई करने के लिए अनुमति देता है. Recombineering के लिए, fosmid SW106 बैक्टीरियल तनाव (mcrA Δ (mrr hsdRMS - mcrBC) ΔlacX74 deor endA1 araD139 (आरा, लियू) Δ 7697 rpsL recA1 φ80dlacZΔM15 nupG [(λc1857 CRO-bioA) <Tet> हस्तांतरित किया जा आवश्यकता होगी ] (CRO-bioA) <> araC PBAD Cre ΔgalK) (NCI-फ्रेडरिक) तनाव जो λred मुताबिक़ पुनर्संयोजन के जीन की एक तापमान संवेदनशील repressor λ और एक arabinose inducible रचनात्मक recombinase (तालिका 2) 15 के नियंत्रण के तहत किया जाता है.

  1. GeneService से ब्याज की जीन (भारत सरकार) के fosmid क्लोन (कैंब्रिज, ब्रिटेन) Wormb का उपयोग कर के लिएएक गाइड के रूप में ase. जब क्लोनों का चयन, हम है कि लोगों को अनुक्रम के केंद्र में भारत सरकार का चयन करें. पुरुषों है कि पड़ोसी जीन बाहर बेहतर हो, लेकिन खोजने के लिए मुश्किल हो सकता है हो सकता है.
  2. संस्कृति भारत सरकार के लेग में fosmid क्लोन 37 में 12.5 μg / एमएल chloramphenicol युक्त डिग्री सेल्सियस
  3. एक 1.5 एमएल fosmid की रात, संस्कृति और मिनी प्रस्तुत करने fosmid डीएनए Epicentre fosmid प्रस्तुत करने किट (Epicentre जैव प्रौद्योगिकी, मैडिसन, WI) का उपयोग कर आगे बढ़ें. हम वैकल्पिक प्रोटोकॉल का पालन निर्देशों में वर्णित है जो एक पहले कदम पर Riboshredder मिश्रण जोड़ने शामिल हैं.
  4. एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर के साथ fosmid डीएनए एकाग्रता का निर्धारण करते हैं.
  5. 14 एमएल ट्यूब स्नैप - कैप में 32 डिग्री सेल्सियस पर SW106 के लेग शोरबा के साथ एक 5 मिलीलीटर रातोंरात संस्कृति 12.5 chloramphenicol / μg एमएल के साथ बढ़ती electrocompetent SW106 कोशिकाओं की तैयारी
  6. 2 एल फ्लास्क में chloramphenicol के साथ लेग के 100 एमएल में 1 एमएल टीका लगाना. एक आयुध डिपो 600 0.6-.8 SW106 बैक्टीरिया बढ़ने. गर्मी झटका नहीं करो.
  7. 5000xg 5 मिनट के लिए पर centrifugation द्वारा गोली, कोमल vortexing द्वारा गोली resuspend, और 50 एमएल बर्फ ठंड 10% ग्लिसरॉल जोड़ें. इस धोने कदम एक बार दोहराएँ.
  8. गोली centrifugation द्वारा SW106 और aspirate सभी लेकिन प्रत्येक सतह पर तैरनेवाला के 500 μl ~
  9. कोमल vortexing द्वारा छर्रों Resuspend. तरल नाइट्रोजन में या सूखी बर्फ पर 100 μl aliquots, और -80 पर दुकान डिग्री सेल्सियस भविष्य के उपयोग के लिए स्थिर.
  10. Electrocompetent SW106 कोशिकाओं में ~ fosmid डीएनए के 50 एनजी 1350 वोल्ट पर 0.1 सेमी अंतराल cuvettes में एक Eppendorf 2510 electroporator का उपयोग कर के साथ बैक्टीरिया electroporating द्वारा fosmid डीएनए रूपांतरण.
  11. 1 घंटे के लिए 1 एमएल लेग में 32 डिग्री सेल्सियस पर बैक्टीरिया का पुनर्प्राप्त
  12. लेग प्लेटों पर chloramphenicol (12.5 μg / एमएल) और सेते साथ 32 ° रातोंरात सी प्लेट aliquots.
  13. कॉलोनी पीसीआर द्वारा भारत सरकार की उपस्थिति की पुष्टि करें. 12.5 μg / एमएल chloramphenicol के साथ 32 डिग्री सेल्सियस पर 5 एमएल लेग में रातोंरात संस्कृति विकसित करने Flanking oligos के साथ एक मानक पीसीआर प्रतिक्रिया के लिए संस्कृति का 0.5 μL जोड़ें, और 5 मिनट के लिए प्रारंभिक 95 ° ऊष्मायन सी बढ़ाने के बैक्टीरिया पीसीआर से पहले lyse.
  14. लंबी अवधि के भंडारण के लिए एक ग्लिसरॉल स्टॉक तैयार है.

III. GalK जीन के Recombineering द्वारा निवेशन

Fosmid संशोधन के पहले चरण में, galK जीन मुताबिक़ पुनर्संयोजन द्वारा fosmid में डाला जाता है, और सही ढंग से संशोधित fosmids के लिए एकमात्र कार्बन स्रोत (2A चित्रा) के रूप में न्यूनतम galactose युक्त मीडिया पर विकास द्वारा चयनित हैं. SW106 बैक्टीरिया कम से कम मीडिया पर धीरे धीरे बढ़ने और 3-5 दिनों के लिए कालोनियों को देखने के लिए आवश्यक हैं.

  1. MOPS न्यूनतम मीडिया प्लेटें युक्त 0.2% galactose तैयार करें. MOPS न्यूनतम मीडिया Teknova इंक (Hollister, CA) (सूची M2106 #) से उपलब्ध है, लेकिन शामिल ग्लूकोज का उपयोग नहीं है.

    MOPS 0.2% galactose (1 एल) के साथ कम से कम मीडिया
    870 एमएल पानी में 15 ग्राम अगर आटोक्लेव
    55 से कूल डिग्री सेल्सियस और जोड़:
    100 एमएल 10X कम से कम मीडिया MOPS
    5 एमएल 0.2 मिलीग्राम / एमएल घ बायोटिन (फ़िल्टर बाँझ)
    4.5 एमएल 10 मिलीग्राम / एमएल एल leucine (1%, गरम, फिर नीचे ठंडा और बाँझ फ़िल्टर)
    10 एमएल 20% galactose (autoclaved)
    1 एमएल 12.5 मिलीग्राम / EtOH में मिलीलीटर Chloramphenicol
    2.55 एमएल 20% राष्ट्रीय राजमार्ग सीएल 4
    10 एमएल 0.132 एम dibasic पोटेशियम फॉस्फेट
  2. पीसीआर pMOD4 galK जी या pMOD4 galK-जी.टी. ऊपर लिए डिज़ाइन प्राइमरों का उपयोग कैसेट बढ़ाना . हम Phusion (न्यू इंग्लैंड Biolabs, इप्सविच, एमए) या GoTaq (Promega, मैडिसन, WI) का इस्तेमाल किया है.
  3. जेल परिणामस्वरूप बैंड शुद्ध. जेल या Nanodrop स्पेक्ट्रोफोटोमीटर द्वारा उपज यों. इस पीसीआर उत्पाद 3.14 कदम के लिए तैयार है.
  4. SW106 5 मिलीलीटर लेग में chloramphenicol (12.5 μg / μL) के साथ fosmid डीएनए युक्त कोशिकाओं की एक रात संस्कृति टीका लगाना. 32 डिग्री सेल्सियस से बढ़ने
  5. 42 के लिए पानी स्नान मिलाते हुए सेट डिग्री सेल्सियस के लिए एक बाँझ धारक में 250 मिलीलीटर कुप्पी के साथ गर्म. एक मिलाते हुए पानी के स्नान का प्रयोग उच्च दक्षता प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है.
  6. और एक एल 2 फ्लास्क में लेग chloramphenicol के 100 मिलीलीटर के लिए रातोंरात संस्कृति का एक मिलीलीटर जोड़ें. एक 0.6-0.8 आयुध डिपो के लिए आगे बढ़ें. यह आमतौर पर 3-4 घंटे लगते हैं.
  7. 250 मिलीलीटर फ्लास्क और 42 में गर्मी झटका SW106 कोशिकाओं के 50 मिलीलीटर स्थानांतरण डिग्री सेल्सियस ठीक 20 मिनट के लिए. 100 rpm पर एक मिलाते हुए waterbath में 32 ° C पर uninduced नियंत्रण के रूप में शेष बैक्टीरिया छोड़ो.
  8. 10 मिनट के लिए बर्फ पर प्रेरित और uninduced बैक्टीरिया अच्छा है.
  9. दो बाँझ अपकेंद्रित्र ट्यूबों और गोली के लिए नमूने 5 मिनट के लिए ~ 5000xg में स्थानांतरण.
  10. सतह पर तैरनेवाला के सभी डालो और 1 मिलीलीटर बर्फ ठंड कोमल vortexing (यानी 3-4 सेटिंग) द्वारा 10% ग्लिसरॉल में गोली resuspend.
  11. जब resuspended, एक 49 मिलीलीटर ठंडा 10% ग्लिसरॉल जोड़ने के लिए, और 5000 ~ नमूने गोली5 मिनट के लिए XG.
  12. कदम 3.9, 3.10, और 3.11 को फिर से दोहराएँ.
  13. Inverting ट्यूबों के सभी सतह पर तैरनेवाला निकालें, और शेष तरल में गोली (लगभग 500 μL प्रत्येक) resuspend. 100 μL नमूने में विभाज्य, सूखी बर्फ पर स्थिर है, और -80 पर दुकान डिग्री सेल्सियस ये हफ्तों के लिए महीने के लिए अच्छा कर रहे हैं. (हम आम तौर पर यहाँ बंद करो और electroporation अगले दिन प्रदर्शन).
  14. पीसीआर उत्पाद के 150 एनजी 1350 वोल्ट पर एक Eppendorf 2510 electroporator सेट में 0.1 सेमी अंतराल cuvettes का उपयोग कर के साथ प्रेरित किया और uninduced SW106 कोशिकाओं Electroporate.
  15. एक 14 मिलीलीटर फाल्कन ट्यूब में 1 एमएल लेग में बैक्टीरिया पुनर्प्राप्त. 4.5 घंटे के लिए 32 ° C पर सेते हैं.
  16. गोली 15 सेकंड के लिए 13,200 rpm पर एक microfuge में बैक्टीरिया. बैक्टीरिया M9 में resuspended हैं और तब दो बार किसी अमीर मध्यम (नुस्खा के लिए नीचे देखें) हटायें धोया.
    • M9 मध्यम (1 एल)
    • 6g ना 2 HPO 4
    • 3 जी 2 के.एच. पीओ 4
    • 1g एनएच 4 सीएल
    • 0.5g NaCl
    • आटोक्लेव
  17. दूसरा धोने के बाद, सतह पर तैरनेवाला निकाल दिया है और गोली 1 एमएल M9 में M9 (100 μL, μL 1:10 कमजोर पड़ने के 100, और 100 μL 1:100) में MOPS न्यूनतम मीडिया पर धारावाहिक dilutions चढ़ाना पहले resuspended है.
  18. 32 ° सी एक इनक्यूबेटर में 3-5 दिनों सेते हैं. नोट: रोगी के रूप में सच सकारात्मक धीरे धीरे बढ़ने.
  19. स्ट्रीक MacConkey अगर सूचक प्लेटों पर कुछ कालोनियों (बी २,८१,८१० #) 1% galactose और 12.5 μg / एमएल chloramphenicol के साथ पूरक हैं. अंतिम चरण के बाद प्रदर्शित होने कालोनियों के सभी galK + होना चाहिए, लेकिन आदेश में किसी भी galK से छुटकारा पाने के लिए contaminants के, यह महत्वपूर्ण है के लिए दूसरे चरण के लिए आगे बढ़ने से पहले एकल, उज्ज्वल गुलाबी कालोनियों प्राप्त. galK कालोनियों सफेद / बेरंग हो और galK + बैक्टीरिया उज्ज्वल लाल / गुलाबी एक pH परिवर्तन एक रात ऊष्मायन के बाद किण्वित galactose से 32 पर जिसके परिणामस्वरूप के कारण हो जाएगा ° सी.
  20. एक एकल कॉलोनी उठाओ और विकास के लिए 32 पर एक 5 मिलीलीटर + लेग chloramphenicol रातोंरात संस्कृति टीका लगाना डिग्री सेल्सियस
  21. पीसीआर flanking oligos का उपयोग कर के माध्यम से उचित स्थान पर galK जीन की प्रविष्टि की पुष्टि करें. एक मानक पीसीआर प्रतिक्रिया के लिए संस्कृति का 0.5 μL जोड़ें और 5 मिनट के लिए प्रारंभिक 95 ° ऊष्मायन सी बढ़ाने के लिए बैक्टीरिया lyse. पीसीआर उत्पाद galK जीन की उपस्थिति के कारण आकार में upshifted होना चाहिए.
  22. भंडारण के लिए एक ग्लिसरॉल स्टॉक तैयार.

चतुर्थ. GalK Recombineering द्वारा टैग दृश्यों के साथ प्रतिस्थापन

इस चरण में galK जीन वांछित टैग दृश्यों और सही ढंग से संशोधित fosmids के लिए चयन के द्वारा चयनित हैं विषाक्त galactose अनुरूप deoxygalactose (कुत्ता) (चित्रा 2B) द्वारा galK जीन के खिलाफ द्वारा प्रतिस्थापित किया गया है.

  1. MOPS न्यूनतम मीडिया प्लेटें युक्त 0.2% (कुत्ता) deoxygalactose और 0.2% ग्लिसरॉल तैयार करें. MOPS न्यूनतम मीडिया Teknova इंक (Hollister, CA) (सूची M2106 #) से उपलब्ध है, लेकिन शामिल ग्लूकोज का उपयोग नहीं है.

    MOPS 0.2% कुत्ते और ग्लिसरॉल (1 एल) के साथ कम से कम मीडिया
    860 एमएल पानी में 15 ग्राम अगर आटोक्लेव
    55 से कूल डिग्री सेल्सियस और जोड़:
    100 एमएल 10X कम से कम मीडिया MOPS
    5 एमएल 0.2 मिलीग्राम / एमएल घ बायोटिन (फ़िल्टर बाँझ)
    4.5 एमएल 10 मिलीग्राम / एमएल एल leucine (1%, गरम, फिर नीचे ठंडा और बाँझ फ़िल्टर)
    10 एमएल 20% deoxygalactose (फ़िल्टर बाँझ)
    10 एमएल 20% ग्लिसरॉल (autoclaved)
    1 एमएल 12.5 मिलीग्राम / EtOH में मिलीलीटर Chloramphenicol
    2.55 एमएल 20% राष्ट्रीय राजमार्ग सीएल 4
    10 एमएल 0.132 एम dibasic पोटेशियम फॉस्फेट
  2. पीसीआर pMOD4 GFP, pBS1761 (नल एन अवधि), या pBS1479 (नल सी अवधि) से टैग टुकड़े ही पहले दौर में प्रयोग किया जाता है या कम GFP या नल विशिष्ट oligos (1.2 चरण में आंतरिक दृश्यों का उपयोग oligos का उपयोग बढ़ाना ). यदि आप एकाधिक constructs कर रहे हैं, यह विशेष रूप से कम oligos के रूप में एक ही पीसीआर उत्पाद constructs के सभी के लिए इस्तेमाल किया जा सकता का उपयोग करने के लिए उपयोगी है.
  3. जेल पीसीआर उत्पाद शुद्ध और जेल या spectrophotometry के माध्यम से एकाग्रता को मापने.
  4. प्रेरित और सक्षम galK निम्न चरणों का पालन डाला 3.4-3.13 ऊपर जीन के साथ fosmid ले जाने SW106 uninduced उत्पन्न .
  5. ~ पीसीआर उत्पाद के 100 एनजी एक Eppendorf 2510 electroporator सेट में 1350 वोल्ट पर 0.1 सेमी अंतराल cuvettes का उपयोग कर के साथ प्रेरित किया और uninduced SW106 कोशिकाओं Electroporate.
  6. एक 14 मिलीलीटर स्नैप - टोपी और एक 4.5 घंटे के लिए 32 डिग्री सेल्सियस प्रकार के बरतन में ट्यूब सेते में 1 मिलीलीटर लेग में पुनर्प्राप्त.
  7. धोने और कदम 3.16 और 3.17 के रूप में बैक्टीरिया पतला. MOPS न्यूनतम मीडिया 0.2% 2 - डिओक्सी - galactose (कुत्ता) और 0.2% ग्लिसरॉल युक्त प्लेटों पर प्लेट बैक्टीरिया.
  8. 32 ° C पर तीन दिनों के लिए सेते हैं.
  9. चार कालोनियों 5 एमएल बनाने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं12.5 μg / एमएल chloramphenicol के साथ लेग में रात भर संस्कृतियों. ये कॉलोनी पीसीआर के लिए उपयोग किया जाता है ऊपर के रूप में पुष्टि करने के लिए कि कैसेट डाला गया था. हम दोनों छोटे GFP का उपयोग करें / विशिष्ट oligos और flanking oligos नल सही डालने और सही साइट प्रदर्शित. GFP ~ 800 बीपी और नल ~ 550 बीपी है जबकि galK 1.4 केबी है.
  10. ग्लिसरॉल स्टॉक तैयार है.

Unc 119 जीन के रचनात्मक - loxP पुनर्संयोजन द्वारा वी. जोड़

Biolistic बमबारी के प्रयोग के माध्यम से संशोधित fosmids साथ ट्रांसजेनिक जानवर पैदा करने की एक आम का मतलब है. इस तकनीक डीएनए लेपित सोने के कणों का उपयोग करता है सी. में fosmid डीएनए परिचय एलिगेंस. ट्रांसजेनिक जानवरों आम तौर पर एक transgene unc-119 के साथ उत्परिवर्ती unc - 119 के बचाव के माध्यम से पहचाने जाते हैं. इस चरण में, unc-119 जीन pLoxP के साथ रचनात्मक - loxP पुनर्संयोजन द्वारा सीआईएस में fosmid रीढ़ की हड्डी को जोड़ा जाता है unc 119 प्लाज्मिड (चित्रा 2C) .

  1. सक्षम SW106 4.9 कदम 2.5-2.9 चरणों का उपयोग कर से संशोधित fosmid ले जाने बैक्टीरिया तैयार. 42 पर नहीं प्रेरित क्या डिग्री सेल्सियस
  2. 50 एनजी के साथ Electroporate. pLoxP एक Eppendorf 2510 1350 वोल्ट पर सेट electroporator में 0.1 सेमी अंतराल cuvettes का उपयोग मिनी - प्रस्तुत करने से unc-119 .
  3. 1 घंटे के लिए 0.1% arabinose युक्त लेग में 32 डिग्री सेल्सियस पर बैक्टीरिया का पुनर्प्राप्त
  4. लेग 50μg/mL एम्पीसिलीन और 12.5 μg / एमएल chloramphenicol युक्त प्लेटों पर प्लेट aliquots. 32 डिग्री सेल्सियस रातोंरात सेते हैं. जो fosmid में pLoxP unc-119 के एकीकरण के लिए चुनता है.
  5. 50μg/mL एम्पीसिलीन और 12.5 μg / एमएल chloramphenicol वाले लेग में एक रात में संस्कृति हो जाओ. पीसीआर के लिए 0.5 μL प्रयोग unc - 119 एफ unc 119 (5'-CAAATCCGTGACCTCGACAC-3 ') और आर (unc 5'-CACAGTTGTTTCTCGAATTTGG-3-119' oligos) (तालिका 1) के साथ जीन की उपस्थिति की पुष्टि.
  6. अंतिम fosmid की एक ग्लिसरॉल शेयर करें.

छठी. बड़े पैमाने पर Fosmid तैयारी

Fosmid बमबारी के लिए आवश्यक डीएनए की बड़ी मात्रा में प्राप्त करने को सुविधाजनक बनाने के लिए, इस कदम में fosmid EPI300 बैक्टीरिया को सौंप दिया है. इस तनाव fosmid प्रतिलिपि संख्या में वृद्धि करने के लिए डीएनए की तैयारी के दौरान पैदावार बढ़ाने की क्षमता है.

  1. एम्पीसिलीन और chloramphenicol युक्त लेग में 5.5 कदम से 32 डिग्री सेल्सियस पर एक 5 एमएल जीवाणुओं की रात संस्कृति विकसित करने संस्कृति का 1.5 एमएल से fosmid अलग Epicentre fosmid प्रस्तुत करने किट का उपयोग करें.
  2. ~ EPI300 एक Eppendorf 2510 1350 वोल्ट पर electroporator सेट में 0.1 सेमी अंतराल cuvettes का उपयोग बैक्टीरिया में 50 एनजी Electroporate. EPI300 बैक्टीरिया Epicentre जैव प्रौद्योगिकी (मैडिसन, WI) से खरीदा जा सकता है.
  3. 1 घंटे के लिए लेग में 37 पर बैक्टीरिया का पुनर्प्राप्त डिग्री सेल्सियस लेग अगर प्लेट aliquots 50 μg / एमएल और 12.5 μg / एमएल chloramphenicol युक्त.
  4. बढ़ो और EPI300 संशोधित fosmid शामिल निर्देश का उपयोग युक्त बैक्टीरिया प्रेरित. एक 50 एमएल प्रेरित संस्कृति> fosmid डीएनए शुद्ध के 10 μg दे देंगे. Epicentre fosmid प्रस्तुत करने किट के साथ fosmid शुद्ध.

सातवीं. गोलाबाज़ी

  1. 10 μg का उपयोग करें. fosmid बौछार करने के लिए डीएनए के DP38 कीड़ा तनाव के रूप में वर्णित (डी. Hochbaum, ए फर्ग्यूसन, और ए फिशर, जौव, प्रेस में).

आठवीं. प्रतिनिधि परिणाम

नकारात्मक चयन चरण में मजबूत और> 90% की सफलता दर recombineering के माध्यम से fosmids के संशोधन नियमित 2 मनाया जाता है. इस प्रोटोकॉल भी ~ 2 सप्ताह पूरा करने के लिए जो काफी तेजी transgenes की तैयारी करता है लेता है. प्रोटोकॉल भी 20 सफलता के साथ अन्य प्रयोगशालाओं द्वारा की कोशिश की गई है है.

Oligo अनुक्रम
सी अवधि नल ​​एफ ATGGAAAAGAGAAGATGGAAAAAG
सी अवधि नल ​​आर GGTTGACTTCCCCGC
GFP-एफ झंडा ATGGATTACAAGGACGATGACGATAAGATGAG
आर ध्वज - GFP CAAAGCTTGTGGGCTTTTGTATAG
एन अवधि नल ​​एफ ATGGCAGGCCTTGCGC
N अवधि के नल आर AAGTGCCCCGGAGGATGAGATTTTCT
galK एफ CCTGTTGACAATTAATCATCGGCA
galK आर TCAGCACTGTCCTGCTCCT
unc-119 F CAAATCCGTGACCTCGACAC
आर unc - 119 CACAGTTGTTTCTCGAATTTGG

तालिका 1. पीसीआर के लिए इस्तेमाल किया oligonucleotides.

प्लास्मिड स्रोत पर उपलब्ध
Fosmid क्लोन Geneservice लिमिटेड Geneservice
pGalK 15 NCI-फ्रेडरिक
pMOD4 RT-G 2 Addgene
pMOD4 - galK जी
pMOD4 - galK - जीटी
pLoxP - unc - 119
pMOD4 - GFP
जीवाणु
SW106 15 NCI-फ्रेडरिक
EPI300 Epicentre Biotechnologies Epicentre
EC100D पीर - 116

तालिका 2 तनाव और वेक्टर उपलब्धता.


चित्रा 1.
PMOD4 - galK जी, और pMOD4 galK-जी.टी., pMOD4 GFP pLoxP unc 119 के आरेख
प्लाज्मिड pMOD4 - galk जी galK (काला) कैसेट 50 nucleotide 5 'और 3' ध्वज के सिरों (ब्राउन) - GFP (हरा) समान क्षेत्रों द्वारा flanked के होते हैं जबकि pMOD 4-galK-जी.टी. galK के होते हैं दोनों फ्लैग GFP अनुरूपता क्षेत्रों और 50 nucleotide क्षेत्रों 5 'और 3' एन टर्मिनल और सी - टर्मिनल (नीले और नारंगी, क्रमशः) नल के सिरों समान द्वारा flanked कैसेट. pMOD4 - ध्वज - GFP एक 5 'झंडा टैग और unc-119 pLoxP unc loxP साइट युक्त प्लाज्मिड में 119 जीनोमिक अनुक्रम (बैंगनी) के होते हैं के साथ पूरा GFP कैसेट के होते हैं. सभी plasmids R6K आधारित pMOD4 (लाल) रीढ़ की हड्डी है जो SW106 में दोहराने में असमर्थ है उपयोग.

चित्रा 2.
GalK recombineering प्रक्रिया का अवलोकन
चित्रा 2A-2C अलग आंकड़े दिखा चरणों और समय galK कैसेट का उपयोग recombineering में शामिल . ये वही आंकड़े हैं कि आंकड़ा 2d में विलय कर रहे हैं, लेकिन स्पष्टता और पढ़ने में आसानी के लिए अलग से प्रदान कर रहे हैं. ब्याज की एक fosmid पहले galK 50 समरूपता के फ्लैग GFP या नल (2A चित्रा) के लिए बीपी क्षेत्रों में फ्लैग GFP या नल के द्वारा इस कैसेट के प्रतिस्थापन द्वारा पीछा द्वारा flanked कैसेट की प्रविष्टि शामिल एक दो कदम प्रक्रिया में संशोधित किया गया है ( चित्रा 2B). बाद में ट्रांसजेनिक जानवर पैदा करने में उपयोग के लिए मार्कर unc-119 LoxP साइट में fosmid रीढ़ की हड्डी (चित्र 2C) पर डाला जाता है.
चित्रा 2 डी galK recombineering प्रक्रिया के मर्ज किए गए आंकड़ा दिखाता है.
GalK recombineering के रूप में ऊपर सहित 2A-2C चित्रा विलय से हर कदम के लिए आवश्यक समय में वर्णित प्रक्रिया की रूपरेखा.


चित्रा 2a galk recombineering में galk सम्मिलन.


चित्रा 2b galk recombineering में सम्मिलन टैग (GFP / नल).


चित्रा 2c unc-119 के अलावा.


चित्रा 2d. Galk recombineering के मर्ज किए गए सिंहावलोकन.

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Discussion

fosmids से transgenes की पीढ़ी देशी प्रमोटर तत्वों, ब्याह वेरिएंट, और 3 'UTR नियामक तत्वों के सभी बनाए रखने का लाभ प्रदान करता है. यह एक transgene है जो देशी अभिव्यक्ति पैटर्न, या जब अन्य तरीकों 5 असफल एक कार्यात्मक transgene के निर्माण के चिंतनशील है के निर्माण के लिए नेतृत्व कर सकते हैं . परिणामस्वरूप transgenes GFP या एक नल टैग सहित मिलान टैग की एक किस्म ले सकते हैं.

transgenes का निर्माण तीन चरणों का है जो सभी SW106 बैक्टीरिया का दाग 15 में बाहर ले रहे हैं शामिल है. सबसे पहले, galK जीन fosmid में वांछित साइट पर एक पीसीआर उत्पाद ले जाने के लक्ष्य fosmid पूरक अनुरूपता हथियार द्वारा flanked galK के साथ recombineering के माध्यम से संशोधित किया जा में एकीकृत है. हम विकसित एक सुधार या तो झंडा - GFP या galK fosmid संशोधन के पहले और दूसरे चरणों के लिए इस्तेमाल किया जा और oligos की लागत को कम oligos का एक सेट की अनुमति कैसेट में एक नल टैग के लिए अनुरूपता क्षेत्रों के एकीकरण है. एक और सरलीकरण एक R6K आधारित सदिश है, जो SW106 बैक्टीरियल तनाव में दोहराने में असमर्थ है और माता पिता वेक्टर को पचाने की जरूरत समाप्त का उपयोग है. दूसरा, galK कैसेट GFP या नल जो तब fosmid पर ब्याज की जीन के साथ जुड़े हुए हैं जैसे टैग के साथ बदल दिया है. यह कदम बहुत मजबूत है और कई fosmids सही ढंग से संशोधित नियमित प्राप्त कर रहे हैं. अंत में, unc 119 ट्रांसजेनिक कीड़े की पीढ़ी के लिए चयन मार्कर fosmid करने के लिए जोड़ा है . इस सीआईएस में एक मार्कर बनाता है और सीधे संशोधित fosmid से जुड़े. unc 119 चयन मार्कर और व्यापक रूप से दोनों microinjection और biolistic 17,21 बमबारी के साथ संगत है . बमबारी विशेष रूप से उपयोगी है ट्रांसजेनिक लाइनों की बड़ी संख्या के रूप में एक एकल परीक्षण से उत्पन्न किया जा सकता है है और भी अनुभवहीन कर्मियों ट्रांसजेनिक जानवर बना सकते हैं.

इस प्रोटोकॉल का एक प्रमुख पहलू SW106 सक्षम कोशिकाओं की तैयारी के दौरान गर्मी झटका चरणों के लिए एक मिलाते हुए पानी स्नान इनक्यूबेटर का उपयोग है. हमने पाया है कि एक हवा इनक्यूबेटर का उपयोग करने के लिए 42 बैक्टीरियल संस्कृति गर्मी में असमर्थ था ° सी भी हिलनेवाला (नहीं दिखाया गया है) में 30 मिनट के बाद. हम भी suboptimal परिणाम (नहीं दिखाया गया है) के साथ एक पानी के स्नान में बैक्टीरिया डुबो करने की कोशिश की. एक मिलाते हुए पानी के स्नान खरीदा जा सकता है नहीं तो पहले से ही कंपनियों को प्रयोगशाला में उपलब्ध की एक संख्या से इस्तेमाल किया जा सकता है.

GFP या मिलान टैग की प्रविष्टि के अलावा, हम भी कीड़ा fosmids (ए फर्ग्यूसन और ए फिशर, अप्रकाशित) पर किए गए जीन की साइट विशिष्ट mutagenesis के लिए इस तकनीक का उपयोग शुरू कर दिया है. यह एक एकल असहाय साइट galK जीन की जगह 50 अपस्ट्रीम और डाउनस्ट्रीम बीपी द्वारा flanked परिवर्तन युक्त oligo के उपयोग के माध्यम से पूरा किया गया था. fosmid mutagenesis के संयोजन के लिए एक जीन पीटा उत्परिवर्ती का उपयोग के साथ मिलकर विशेष जीन isoforms, डोमेन, या विशिष्ट एमिनो एसिड के लिए निर्धारित किया जा के vivo समारोह में अनुमति दे सकता है. इसके अलावा हमारे प्रोटोकॉल अंत में galK मार्कर को हटा है तो यह संभव है करने के लिए संशोधन करने के लिए अतिरिक्त मिलान टैग डालने या एक टैग का निर्माण पर mutagenesis के प्रदर्शन के अतिरिक्त राउंड प्रदर्शन.

अंत में, यह संभावना है कि इन अभिकर्मकों के कुछ का उपयोग कीड़े नहीं प्रयोगशालाओं द्वारा संशोधित BACS या fosmids के निर्माण में इस्तेमाल किया जा सकता है. galK जी pMOD4 और pMOD4 galK जी.टी. जीन अभी भी पूरे galK जीन अब पहले प्रकाशित oligos अभी भी galK 15 जीन बढ़ाना इस्तेमाल किया जा सकता है बनाए रखने. के साथ संबंध है R6K प्रतिकृति मूल का उपयोग ज़रूरत प्लाज्मिड माता पिता को पचाने नहीं यह अभी भी लाभ को बनाए रखने के लिए या ध्यान से पीसीआर उत्पाद शुद्ध.

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

लेखकों Lindsey नैश के लिए तकनीक विकसित करने के साथ मदद के लिए धन्यवाद देना चाहूंगा. इस काम NIH अनुदान AG028977 द्वारा ALF, पिट्सबर्ग विश्वविद्यालय से एक पायलट और पिट्सबर्ग OAIC विश्वविद्यालय (AG024827), और बीज धन से परियोजना अनुदान के लिए वित्त पोषित किया गया था.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
FosmidMAX kit Epicentre Biotechnologies FMAX046
GoTaq Promega Corp. M7122
MOPS Media TEKnova, Inc. M2120
0.132 M Potassium phosphate solution TEKnova, Inc. M2102
D-galactose Sigma-Aldrich G0750
2-deoxygalactose Sigma-Aldrich D4407
Biotin Sigma-Aldrich B4639
Leucine Sigma-Aldrich L8000
NH4Cl Sigma-Aldrich A9434
Phusion DNA polymerase New England Biolabs F-530S
MacConkey agar base BD Biosciences 281810
Arabinose Sigma-Aldrich A3131
Chloramphenicol Sigma-Aldrich C1919
Sodium phosphate dibasic Sigma-Aldrich S5136
Potassium phosphate monobasic Sigma-Aldrich P5655
Sodium chloride Sigma-Aldrich S5886
Glycerol Sigma-Aldrich G2025
Bacto Agar BD Biosciences 214010

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References

  1. Mello, C., Fire, A. DNA transformation. Methods Cell Biol. 48, 451-482 (1995).
  2. Zhang, Y., Nash, L., Fisher, A. L. A simplified, robust, and streamlined procedure for the production of C. elegans transgenes via recombineering. BMC Dev Biol. 8, 119-119 (2008).
  3. Antebi, A., Yeh, W. H., Tait, D., Hedgecock, E. M., Riddle, D. L. daf-12 encodes a nuclear receptor that regulates the dauer diapause and developmental age in C. elegans. Genes and Development. 14, 1512-1527 (2000).
  4. Snow, M. I., Larsen, P. L. Structure and expression of daf-12: a nuclear hormone receptor with three isoforms that are involved in development and aging in Caenorhabditis elegans. Biochim. Biophys. Acta. 1494, 104-116 (2000).
  5. Fisher, A. L., Page, K. E., Lithgow, G. J., Nash, L. The Caenorhabditis elegans K10C2.4 Gene Encodes a Member of the Fumarylacetoacetate Hydrolase Family. A CAENORHABDITIS ELEGANS MODEL OF TYPE I TYROSINEMIA. J Biol.Chem. 283, 9127-9135 (2008).
  6. Wightman, B., Ha, I., Ruvkun, G. Posttranscriptional regulation of the heterochronic gene lin-14 by lin-4 mediates temporal pattern formation in C. elegans. Cell. 75, 855-862 (1993).
  7. Lehrbach, N. J. LIN-28 and the poly(U) polymerase PUP-2 regulate let-7 microRNA processing in Caenorhabditis elegans. Nat Struct Mol Biol. 16, 1016-1020 (2009).
  8. Tursun, B., Cochella, L., Carrera, I., Hobert, O. A toolkit and robust pipeline for the generation of fosmid-based reporter genes in C. elegans. PLoS One. 4, e4625-e4625 (2009).
  9. Bamps, S., Hope, I. A. Large-scale gene expression pattern analysis, in situ, in Caenorhabditis elegans. Brief. Funct. Genomic. Proteomic. , (2008).
  10. Dolphin, C. T., Hope, I. A. Caenorhabditis elegans reporter fusion genes generated by seamless modification of large genomic DNA clones. Nucleic Acids Res. 34, e72-e72 (2006).
  11. Sarov, M. A recombineering pipeline for functional genomics applied to Caenorhabditis elegans. Nat. Methods. 3, 839-844 (2006).
  12. Yang, X. W., Model, P., Heintz, N. Homologous recombination based modification in Escherichia coli and germline transmission in transgenic mice of a bacterial artificial chromosome. Nat Biotechnol. 15, 859-865 (1997).
  13. Court, D. L., Sawitzke, J. A., Thomason, L. C. Genetic engineering using homologous recombination. Annu.Rev.Genet. 36, 361-388 (2002).
  14. Westenberg, M., Bamps, S., Soedling, H., Hope, I. A., Dolphin, C. T. Escherichia coli MW005: lambda Red-mediated recombineering and copy-number induction of oriV-equipped constructs in a single host. BMC Biotechnol. 10, 27-27 (2010).
  15. Warming, S., Costantino, N., Court, D. L., Jenkins, N. A., Copeland, N. G. Simple and highly efficient BAC recombineering using galK selection. Nucleic Acids Res. 33, e36-e36 (2005).
  16. Penfold, R. J., Pemberton, J. M. An improved suicide vector for construction of chromosomal insertion mutations in bacteria. Gene. 118, 145-146 (1992).
  17. Praitis, V., Casey, E., Collar, D., Austin, J. Creation of low-copy integrated transgenic lines in Caenorhabditis elegans. Genetics. 157, 1217-1226 (2001).
  18. Puig, O. The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification. Methods. 24, 218-229 (2001).
  19. Rigaut, G. A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration. Nat.Biotechnol. 17, 1030-1032 (1999).
  20. Achilleos, A., Wehman, A. M., Nance, J. PAR-3 mediates the initial clustering and apical localization of junction and polarity proteins during C. elegans intestinal epithelial cell polarization. Development. 137, 1833-1842 (2010).
  21. Maduro, M., Pilgrim, D. Identification and cloning of unc-119, a gene expressed in the Caenorhabditis elegans nervous system. Genetics. 141, 977-988 (1995).

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जेनेटिक्स 47 अंक सी एलिगेंस transgenes fosmid क्लोन galK recombineering मुताबिक़ पुनर्संयोजन ई. कोलाई
का उत्पादन<em> सी. एलिगेंस</em> Recombineering के साथ के माध्यम से transgenes<em> GalK</em> चयन मार्कर
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Zhang, Y., Kashyap, L., Ferguson, A. A., Fisher, A. L. The Production of C. elegans Transgenes via Recombineering with the galK Selectable Marker. J. Vis. Exp. (47), e2331, doi:10.3791/2331 (2011).

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