Summary
Förmågan att producera transgener för
Abstract
Skapandet av transgena djur är allmänt används i C. elegans forskning inklusive användningen av GFP fusionsproteiner att studera reglering och uttryck mönster av gener av intresse eller generering av tandem affinitet rening (TAP) taggade versioner av specifika gener för att underlätta deras rening. Normalt transgener genereras genom att placera en främjare före ett GFP reporter gen eller cDNA av intresse, och detta ger ofta ett representativt uttryck mönster. Men, kritiska delar av genreglering, såsom kontroll element i 3 'oöversatta regionen eller initiativtagare alternativ skulle kunna missas av denna strategi. Ytterligare en enda skarv variant kan oftast studeras på detta sätt. Däremot innefattar användning av masken arvsmassans DNA bärs av fosmid DNA-kloner sannolikt de flesta om inte alla element som ingår i genreglering in vivo som tillåter större förmåga att fånga det äkta uttrycket mönster och timing. För att underlätta skapandet av transgener använda fosmid DNA, beskriver vi ett E. coli baserade recombineering för att infoga GFP, en TAP-tagg eller andra sekvenser av intresse i någon plats i genen. Förfarandet använder galK genen som val markör för både positiva och negativa val steg i recombineering vilket resulterar i att få den önskade ändringen med hög verkningsgrad. Vidare plasmider innehåller galK genen flankerad av homologi vapen till vanliga GFP och TAP fusionsgener finns tillgängliga som minskar kostnaderna för oligos med 50% när du genererar en GFP eller TAP fusionsprotein. Dessa plasmider använda R6K replikering ursprung som utesluter behovet av omfattande PCR-produkt rening. Slutligen visar vi också en teknik för att integrera UNC-119 markör på den fosmid ryggrad som gör att fosmid vara direkt injiceras eller bombarderas med maskar för att skapa transgena djur. Denna video demonstrerar förfarandet i samband generera en transgen via recombineering med denna metod.
Protocol
Översikt
Många transgener används i produktionen av transgena C. elegans består av promotorn sekvenser och kanske en gen cDNA klonad till en av de vektorer som genereras av lab av Dr Andy Fire 1. Även om dessa transgener är ofta framgångsrika när det gäller att producera en gen GFP reporter eller uttrycker ett cDNA i önskad mönster, kan dessa transgener saknar alternativa initiativtagare, förstärkare element och 3 "oöversatta regionen (UTR) element som spelar en viktig roll i kontrollen av genuttryck in vivo 2. Till exempel, både DAF-12 och Fah-1 gener har viktiga enhancer element som ligger utanför den proximala promotor som missade i promotor bara konstruktioner 3,4,5. Ytterligare många transgenen konstruktioner använder UNC-54 3'UTR vilket förhindrar reglering av lämpliga mikroRNA gener 6,7,8. Följaktligen skulle generera transgener med stora delar av masken arvsmassans DNA vara idealisk för att fånga alla projektansvariga, varianter skarva och 3 'UTR kontrollelement. Nyligen ett C. elegans fosmid bibliotek som består av ~ 40 kb regioner i arvsmassans DNA och täcker nästan hela genomet har konstruerats. Användningen av masken arvsmassans DNA transporteras med dessa fosmid DNA-kloner resultat i större förmåga att fånga det äkta uttrycket mönster och tidpunkten för specifika gener 2,8,9,10,11.
Men att arbeta med stora regioner i arvsmassans DNA innebär praktiska utmaningar som de stora svårigheter att använda vanliga molekylärbiologisk teknik 12. För att övervinna dessa begränsningar, till tekniker ändra fosmids eller bakteriell artificiella kromosomer via homolog rekombination i E. coli har utvecklats och kallas recombineering 12,13. Recombineering möjliggör sömlös införandet av GFP, en tandem affinitet rening (TAP)-taggen, eller andra sekvenser av intresse i någon plats i den gen som bärs av C. elegans fosmid klon 2,10,14. Homolog rekombination sker mellan en PCR-produkt flankeras av 50 bp regioner homologi till målsidan och mål-DNA i särskilt modifierat E. coli stammar.
Vi har nyligen beskrivit ett förfarande i två steg för modifiering av C. elegans fosmids av recombineering som innebär att sätta in galK genen på önskad plats och sedan ersätta denna gen med den önskade sekvensen 2. Den galK genen fungerar som ett effektivt urval markör för båda stegen i processen eftersom det kan väljas för och emot genom användning av selektiva odlingsmedium 15. I det första skedet av fosmid modifiering är galK genen in genom homolog rekombination vid önskad plats och korrekt uppdaterad fosmids identifieras av positiv selektion för förmågan att utnyttja galaktos som kolkälla 2,15. I det andra steget är galK genen ersatts av den önskade sekvensen, och korrekt ändrade fosmids identifieras genom negativ selektion mot galK genen genom användning av giftiga galaktos derivatan deoxygalactose som dödar galK + bakterier 2,15. En fördel med galK är förmågan hos en enda gen som ska användas för de positiva och negativa val steg, i stället för andra markörer som har separata gener för varje steg, och resulterar i att få den önskade ändringen med hög verkningsgrad 2,15.
För att underlätta tillämpningen av denna teknik till C. elegans forskning gjorde vi flera ändringar i de tillgängliga resurserna. Först är de GFP och TAP-taggar som ofta används för att generera mask transgener, så vi byggde på 50 räntepunkter regioner homologi till var och en av dessa taggar i pMOD4 galK-G och pMOD4 galK-GT plasmider som tjänar som källa för galK genen 2. Dessa regioner kan en enda uppsättning oligos som ska användas för båda leden i fosmid ändring som sparar behovet av att beställa en andra omgång något dyrt oligos. För det andra, dessa plasmider använda R6K replikering ursprung som utesluter behovet av att smälta förälder plasmid eller omfattande PCR-produkt rening som förälder plasmiden inte kan replikera på de bakterier som används för recombineering, och kan bara replikera i särskilda stammar som EC100 2 , 16 (tabell 1 och 2). Slutligen, ett vanligt sätt att skapa transgena C. elegans är genom att använda biolistic bombardemang följt av val för transgena maskarna via rädda för UNC-119 mutation 17. För att göra fosmids kompatibel med beskjutning, vi utvecklat pLoxP UNC-119 plasmid som kan användas för att integrera UNC-119 markör på den fosmid ryggraden 2.
I. Oligo Design
Med recombineering önskade sekvenser kan infogas på andra ställen inom genen. Vanliga platser är på 5 "slutet eller 3" slutet beroende på funktionella domäner, varianter skarva, eller post-translationella modifieringar, såsom klyvning av proteaser. Den pMOD4 GFP plasmid som skapats av vårt laboratorium kan användas för att infoga en FLAG-märkta GFP vid varje plats som plasmiden innehåller en initiativtagare kodon och saknar en 3 "stop kodon (figur 1). Däremot har TAP märka specifika versioner för 5 "och 3" fusioner på grund av TEV klyvningen används vid rening 18,19.
- Planera platsen för taggen insättning inom genen. Överväg alternativa promotorer, funktionella domäner, alternativa skivning, och post-translationella modifieringar när man överväger insättningsstället. Olika införingsställen kunde användas för att märka alla, en, eller några isoformer av en specifik gen. Identifiera 50 bp regioner uppströms och nedströms insättningspunkten.
- Designa oligos (tabell 1). Antingen 100 nM skala - kan gel renas oligos eller Ultramer oligos från integrerade DNA-teknik användas för förfarandet.
För att utföra galK recombineering måste du utforma galK primers med 50 räntepunkter homologi till ett område som flankerar den önskade platsen som ska ändras och 3 "slutet av dessa primers binder till galK kassett, som finns i både pMOD4 galK-G och pMOD4 galK-GT (Figur 1). Det främre oligo kommer att 5'------- 50 räntepunkter homologi ------- CCTGTTGACAATTAATCATCGGCA-3 "och omvända en så 5'------- 50 bp homologi på kompletterande strand - ------ TCAGCACTGTCCTGCTCCT-3 ".
För att utföra galK recombineering med GFP måste du utforma pMOD4 galK-G eller pMOD4 galK-GT primers med 50 räntepunkter homologi till ett område som flankerar den önskade platsen som ska ändras (figur 1). Var noga med att hålla fusionsproteinet i ram. Den ATG kan kastas om så önskas. Den 3 'änden av dessa primers binder till regioner i GFP homologi flankerar galK kassetten. Obs: första och sista kodon av GFP är understrukna för att demonstrera läsram. Det främre oligo kommer att 5'------- 50 räntepunkter homologi ------- ATG GATTACAAGGACGATGACGATAAGATGAG -3 "3" och omvända en 5'------- 50 bp homologi på kompletterande del ------- Luftfartsverket AGCTTGTGGGCTTTTGTATAG-3 "
För att utföra galK C sikt TAP recombineering måste du utforma pMOD4 galK-GT primers med 50 räntepunkter homologi till ett område som flankerar den önskade platsen som ska ändras (figur 1). Var noga med att hålla fusionsproteinet i ram. Den 3 'änden av dessa primers binder till regioner i TAP homologi flankerar galK kassetten. Obs: första och sista kodon TAP är understrukna för att demonstrera läsram. Det främre oligo kommer att 5'------- 50 räntepunkter homologi ------ ATG GAAAAGAGAAGATGGAAAAAG - -3 "och omvända en 5'------- 50 bp homologi på kompletterande strand - ------ GGT TGACTTCCCCGC -3 "
För att utföra galK N sikt TAP recombineering måste du utforma pMOD4 galK-GT primers med 50 räntepunkter homologi till ett område som flankerar den önskade platsen som ska ändras (figur 1). Var noga med att hålla fusionsproteinet i ram. Den 3 'änden av dessa primers binder till regioner i TAP homologi flankerar galK kassetten. Obs: första och sista kodon TAP är understrukna för att demonstrera läsram. Det främre oligo kommer att 5'------- 50 räntepunkter homologi ------ ATG GCAGGCCTTGCGC - -3 "och omvända en 5'------- 50 bp homologi på kompletterande strand - ------ AAG TGCCCCGGAGGATGAGATTTTCT -3 " - Generera en uppsättning kompletterande oligos för PCR i senare steg samt för sekvensering av fosmid. Dessa är standard PCR oligos som bör förena ~ 100 BP uppströms och nedströms insticksstället.
II. Överföring Fosmid till SW016 Bakterier
Den fosmids från C. elegans fosmid bibliotek finns i EPI300 bakteriestam (F-mcrA Δ (MRR-hsdRMS-mcrBC) φ80dlacZΔM15 ΔlacX74 recA1 endA1 araD139 Δ (ara, leu) 7697 Galu galK λ-RPSL nupG trfA Tona) (Epicentrum Biotechnologies, Madison, WI ) ger fosmid uttrycket ökas över ett enda exemplar per cell för att förbättra DNA avkastningen under reningen (tabell 2). För recombineering kommer fosmid att behöva överföras till SW106 bakteriestam (mcrA Δ (MRR-hsdRMS-mcrBC) ΔlacX74 deor endA1 araD139 Δ (ara, leu) 7697 RPSL recA1 nupG φ80dlacZΔM15 [λc1857 (CRO-bioA) <> Tet ] (Cro-bioA) <> Arac-PBAD bussavkodarkort Cre ΔgalK) (NCI-Fredrik) stam som bär λred homolog rekombination gener under kontroll av en temperaturkänslig λ repressor och en arabinos inducerbara CRE recombinase (tabell 2) 15.
- Beställ fosmid klon av genen av intresse (indiska) från GeneService (Cambridge, Storbritannien) med WormbASE som vägledning. Vid val av kloner, väljer vi de som har de indiska myndigheterna i mitten av sekvensen. De som utesluter angränsande gener kan vara att föredra men kan vara svårt att hitta.
- Kultur fosmid klon av de indiska myndigheterna i LB innehåller 12,5 mikrogram / ml kloramfenikol vid 37 ° C.
- Odla ett 1,5 ml natten kultur fosmid, och mini-prep fosmid DNA med Epicentrum fosmid prep kit (Epicentrum Biotechnologies, Madison, WI). Vi följer den alternativa protokoll som beskrivs i de anvisningar som innebär att addera Riboshredder blandningen i ett tidigare steg.
- Bestäm fosmid DNA-koncentration med en spektrofotometer.
- Förbered electrocompetent SW106 cellerna genom att odla en 5 ml natten kultur SW106 i en 14 ml snap-lock rör med LB-buljong med 12,5 mikrogram / ml kloramfenikol vid 32 ° C.
- Inokulera 1 ml till 100 ml LB med kloramfenikol i en 2 L kolv. Grow SW106 bakterier till en OD 600 0,6-0,8. Värm inte upp-chock.
- Pellets genom centrifugering vid 5000xg i 5 minuter, suspendera pelleten genom att försiktigt vortexa, och tillsätt 50 ml iskall 10% glycerol. Upprepa tvättningen gång.
- Pelletera SW106 genom centrifugering och aspirera alla, men ~ 500 l av varje supernatant
- Resuspendera pellets genom försiktig vortexa. Frys 100 l alikvoter i flytande kväve eller torris, och förvara vid -80 ° C för framtida bruk.
- Omvandla den fosmid DNA i electrocompetent SW106 celler genom electroporating bakterierna med ~ 50 ng fosmid DNA med en Eppendorf 2510 electroporator vid 1350 volt i 0,1 kyvetter cm lucka.
- Återskapa bakterier i 1 ml LB i 1 timme vid 32 ° C.
- Tavla alikvoter på LB plattor med kloramfenikol (12,5 mikrogram / ml) och inkubera vid 32 ° C över natten.
- Kontrollera förekomsten av de indiska myndigheterna av kolonin PCR. Odla en 5 ml natten kultur i LB med 12,5 mikrogram / ml kloramfenikol vid 32 ° C. Tillsätt 0,5 mikroliter av kultur till en standard PCR reaktion med åtföljande oligos och öka den inledande 95 ° C inkubering till 5 minuter att lysera bakterier innan PCR.
- Förbered en glycerol lager för långtidsförvaring.
III. Införande av galK Gene genom Recombineering
I det första skedet av fosmid modifiering är galK gen sätts in i fosmid av homolog rekombination och korrekt ändrade fosmids väljs genom tillväxt på minimal medier som innehåller galaktos som enda kolkälla (Figur 2A). Den SW106 bakterierna växer långsamt på den minimala media och 3-5 dagar krävs för att se kolonier.
- Förbered MOPS minimal media plattor som innehåller 0,2% galaktos. MOPS minimal medier är tillgängliga från Teknova Inc. (Hollister, Kalifornien) (katalog # M2106) men inte använda den medföljande glukos.
MOPS minimal media med 0,2% galaktos (1 L)
Autoklav 15 gram agar i 870 ml vatten
Kyl till 55 ° C och tillsätt:100 ml 10X MOPS minimal medier 5 ml 0,2 mg / ml d-biotin (sterilt filtrerad) 4,5 ml 10 mg / ml L-leucin (1%, uppvärmd, sedan kyls ner och sterilt filtrerad) 10 ml 20% galaktos (autoklaveras) 1 ml 12,5 mg / ml kloramfenikol i EtOH 2,55 ml 20% NH 4 Cl 10 ml 0,132 M dibasiskt kaliumfosfat - PCR förstärka pMOD4 galK-G eller pMOD4 galK-GT kassetter med primers utformade ovan. Vi har använt Phusion (New England Biolabs, Ipswich, MA) eller GoTaq (Promega, Madison, WI).
- Gel rena leder bandet. Kvantifiera den skörden med gel eller Nanodrop spektrofotometer. Denna PCR-produkten är redo för steg 3,14.
- Inokulera en övernattning kultur av SW106 celler som innehåller fosmid DNA i 5 ml LB med kloramfenikol (12,5 mikrogram / l). Växa i 32 ° C.
- Ställ skakvattenbad till 42 ° C för att värma upp med en steril 250 ml kolv i hållaren. Användning av en skakvattenbad är avgörande för att få hög verkningsgrad.
- Tillsätt 1 ml av natten kultur till 100 ml LB och kloramfenikol i en 2 L kolv. Växa till en OD 0,6-0,8. Detta tar normalt 3-4 timmar.
- Överför 50 ml av SW106 celler till 250 ml-kolven och värme-chock vid 42 ° C i exakt 20 min. i en skakande vattenbad vid 100 rpm Låt det resterande bakterier vid 32 ° C som uninduced kontroll.
- Kyl framkallas och uninduced bakterier på is i 10 minuter.
- Överför proverna till två sterila centrifugrör och pellets på ~ 5000xg i 5 minuter.
- Häll av alla supernatanten och suspendera pelleten i 1 ml iskall 10% glycerol genom försiktig vortexa (dvs inställning 3-4).
- När återsuspenderade, lägga till ytterligare 49 ml iskall 10% glycerol och pellets exemplaren vid ~ 5000xgi 5 minuter.
- Upprepa steg 3,9, 3,10 och 3,11 igen.
- Ta bort alla supernatanten genom att vända rören och suspendera pelleten i den återstående vätskan (ca 500 mikroliter i varje). Alikvotera till 100 mikroliter prov, frysning av kolsyreis och förvara vid -80 ° C. Dessa är bra för veckor till månader. (Vi brukar stanna här och utföra elektroporation följande dag).
- Electroporate de inducerade och uninduced SW106 celler med 150 ng av PCR-produkten med 0,1 kyvetter cm lucka i ett Eppendorf 2510 electroporator satt till 1350 volt.
- Återställ bakterierna i 1 ml LB i en 14 ml Falcon rör. Inkubera vid 32 ° C i 4,5 timmar.
- Pellets bakterierna i ett mikrofugrör vid 13.200 rpm i 15 sekunder. Bakterierna är suspenderade i M9 och sedan tvättas två gånger bort alla rika medium (se nedan för recept).
- M9 medelhög (1 L)
- 6 g Na 2 HPO 4
- 3g KH 2 PO 4
- 1g NH 4 Cl
- 0,5 g NaCl
- AUTOKLAV
- Efter den andra tvätten, är supernatanten bort och pelleten är suspenderade i 1 ml M9 före bordläggning seriespädningar i M9 (100 mikroliter, 100 mikroliter av en 1:10 spädning och 100 mikroliter 1:100) på MOPS minimal media.
- Inkubera 3-5 dagar vid 32 ° C i en inkubator. OBS: Ha tålamod som sant positiva växa långsamt.
- Streak några kolonier på MacConkey tallrikar agar indikator (BD # 281.810) kompletterad med 1% galaktos och kloramfenikol 12,5 mikrogram / ml. Alla de kolonier som uppstått efter det sista steget bör vara galK +, men för att bli av med någon galK - föroreningar, är det viktigt att få singel, ljust rosa kolonier innan du fortsätter med det andra steget. Den galK - kolonier är vit / färglös och galK + bakterierna blir ljust röd / rosa på grund av en pH-förändring till följd av jästa galaktos efter en natts inkubation vid 32 ° C.
- Välj en enda koloni och inokulera en 5 ml LB + kloramfenikol natten kultur för tillväxt vid 32 ° C.
- Bekräfta insättning av galK genen på rätt plats via PCR med flankerande oligos. Tillsätt 0,5 mikroliter av kulturen till en standard PCR-reaktion och öka de inledande 95 ° C inkubering till 5 minuter att lysera bakterier. PCR-produkten bör upshifted i storlek på grund av närvaron av galK genen.
- Förbered en glycerol lager för förvaring.
IV. Byte av galK med taggen sekvenser genom Recombineering
I detta skede galK genen ersätts med önskad tagg sekvenser och korrekt ändrade fosmids väljs genom val mot galK genen av toxiska galaktos analoga deoxygalactose (hund) (Figur 2B).
- Förbered MOPS minimal media plattor som innehåller 0,2% deoxygalactose (hund) och 0,2% glycerol. MOPS minimal medier är tillgängliga från Teknova Inc. (Hollister, Kalifornien) (katalog # M2106) men inte använda den medföljande glukos.
MOPS minimal media med 0,2% HUND och glycerol (1 L)
Autoklav 15 gram agar i 860 ml vatten
Kyl till 55 ° C och tillsätt:100 ml 10X MOPS minimal medier 5 ml 0,2 mg / ml d-biotin (sterilt filtrerad) 4,5 ml 10 mg / ml L-leucin (1%, uppvärmd, sedan kyls ner och sterilt filtrerad) 10 ml 20% deoxygalactose (sterilt filtrerad) 10 ml 20% glycerol (autoklaveras) 1 ml 12,5 mg / ml kloramfenikol i EtOH 2,55 ml 20% NH 4 Cl 10 ml 0,132 M dibasiskt kaliumfosfat - PCR förstärka taggen fragment från pMOD4 GFP, pBS1761 (N sikt TAP) eller pBS1479 (C sikt TAP) med samma oligos används i den första omgången eller med kortare GFP eller TAP-specifika oligos (den inre sekvenser i steg 1,2 ). Om du gör flera konstruktioner är det särskilt lämpligt att använda den kortare oligos som samma PCR-produkten kan användas för alla konstruktioner.
- Gel rena PCR-produkten och mäta koncentrationen via gel eller spektrofotometri.
- Generera framkallas och uninduced behöriga SW106 bär fosmid med galK genen infogas följande steg 3,4-3,13 ovan.
- Electroporate de inducerade och uninduced SW106 celler med ~ 100 ng av PCR-produkten med 0,1 kyvetter cm lucka i ett Eppendorf 2510 electroporator satt till 1350 volt.
- Återhämta sig i 1 ml LB i en 14 ml snap-cap rör och inkubera i 32 ° C shaker i 4,5 timmar.
- Tvätta och späd bakterier som i steg 3,16 och 3,17. Tavla bakterier på MOPS minimal media plattor som innehåller 0,2% 2-deoxy-galaktos (hund) och 0,2% glycerol.
- Inkubera vid 32 ° C i tre dagar.
- Fyra kolonier används för att göra 5 mlnatten kulturer i LB med 12,5 mikrogram / ml kloramfenikol. Dessa används för kolonin PCR enligt ovan för att bekräfta att kassetten sattes in. Vi använder både kortare GFP / TAP specifika oligos och kompletterande oligos att visa rätt sätt och rätt plats. GFP är ~ 800 BP och TAP är ~ 550 BP medan galK är 1,4 kb.
- Förbered en glycerol lager.
V. Tillägg av UNC-119 Gen av CRE-loxP Rekombination
En vanlig metod för att generera transgena djur med den modifierade fosmids är genom att använda biolistic bombardemang. Denna teknik används DNA-belagda guldpartiklar att införa fosmid DNA i C. elegans. Transgena djur identifieras vanligen via rädda för UNC-119 mutant med en UNC-119 transgen. I detta steg är UNC-119 gen läggs till fosmid ryggraden i TIS av ska-loxP rekombination med pLoxP UNC-119 plasmid (figur 2C).
- Förbered behöriga SW106 bakteriebärande den modifierade fosmid från steg 4,9 med steg 2,5-2,9. Framkalla INTE vid 42 ° C.
- Electroporate med 50 ng. pLoxP UNC-119 från en mini-prep med 0,1 kyvetter cm lucka i ett Eppendorf 2510 electroporator satt till 1350 volt.
- Återskapa bakterier i LB innehållande 0,1% arabinos i 1 timme vid 32 ° C.
- Tavla alikvoter på LB plattor som innehåller 50μg/mL ampicillin och 12,5 mikrogram / ml kloramfenikol. Inkubera vid 32 ° C över natten. som väljer att integrera pLoxP UNC-119 i fosmid.
- Odla en övernattning kultur i LB innehåller 50μg/mL ampicillin och 12,5 mikrogram / ml kloramfenikol. Använd 0,5 mikroliter för PCR kontrollera förekomsten av UNC-119 gen med UNC-119 F (5'-CAAATCCGTGACCTCGACAC-3) och UNC-119 R (5'-CACAGTTGTTTCTCGAATTTGG-3 ') oligos (tabell 1).
- Gör en glycerol lager av den slutliga fosmid.
VI. Large Scale Fosmid Förberedelser
För att underlätta att erhålla större mängder fosmid DNA som behövs för beskjutning, i detta steg fosmid överförs till EPI300 bakterier. Denna stam har förmågan att öka fosmid antal kopior för att öka avkastningen under DNA-beredning.
- Odla en 5 ml natten kultur av bakterier från steg 5,5 i LB med ampicillin och kloramfenikol vid 32 ° C. Använd Epicentrum fosmid prep kit för att isolera fosmid från 1,5 ml av kulturen.
- Electroporate ~ 50 ng till EPI300 bakterier med 0,1 kyvetter cm lucka i ett Eppendorf 2510 electroporator satt till 1350 volt. Den EPI300 bakterier kan köpas från Epicentrum Biotechnologies (Madison, WI).
- Återskapa bakterier i LB i 1 timme vid 37 ° C. Tavla alikvoter på LB-agar innehåller 50 mikrogram / ml och 12,5 mikrogram / ml kloramfenikol.
- Odla och inducera EPI300 bakterier som innehåller den modifierade fosmid hjälp av den medföljande instruktionerna. En 50 ml inducerad kultur ger> 10 mikrogram av renat fosmid DNA. Rena fosmid med Epicentrum fosmid prep kit.
VII. Beskjutning
- Använd 10 mikrogram. av fosmid DNA att bombardera DP38 masken stam beskrivs som (D. Hochbaum, A. Ferguson, och A. Fisher, Jove, in press).
VIII. Representativa resultat
Ändringen av fosmids via recombineering robust och priser framgång> 90% i negativt urval steget rutinmässigt iakttas 2. Detta protokoll tar även ~ 2 veckor att slutföra, vilket gör att förbereda transgener ganska snabb. Protokollet har också prövats av andra labb med framgång 20.
| Oligo | Sekvens |
| C-term TAP F | ATGGAAAAGAGAAGATGGAAAAAG |
| C-term TAP R | GGTTGACTTCCCCGC |
| FLAG-GFP F | ATGGATTACAAGGACGATGACGATAAGATGAG |
| FLAG-GFP R | CAAAGCTTGTGGGCTTTTGTATAG |
| N sikt TAP F | ATGGCAGGCCTTGCGC |
| N sikt TAP R | AAGTGCCCCGGAGGATGAGATTTTCT |
| galK F | CCTGTTGACAATTAATCATCGGCA |
| galK R | TCAGCACTGTCCTGCTCCT |
| UNC-119 F | CAAATCCGTGACCTCGACAC |
| UNC-119 R | CACAGTTGTTTCTCGAATTTGG |
Tabell 1. Oligonukleotider används för PCR.
| Plasmider | Källa | Finns på |
| Fosmid klon | Geneservice Ltd | Geneservice |
| pGalK | 15 | NCI-Fredrik |
| pMOD4-RT-G | 2 | Addgene |
| pMOD4-galK-G | ||
| pMOD4-galK-GT | ||
| pLoxP-UNC-119 | ||
| pMOD4-GFP | ||
| Bakterier | ||
| SW106 | 15 | NCI-Fredrik |
| EPI300 | Epicentrum Bioteknik | Epicentrum |
| EC100D PIR-116 | ||
Tabell 2. Sila och vektor tillgänglighet.
Figur 1.
Diagram över pMOD4-galK-G, och pMOD4-galK-GT, pMOD4 GFP, pLoxP-UNC-119
Den pMOD4-galk-G plasmid består av galK kassett (svart) flankeras av 50 nukleotid regioner identisk med 5 "och 3" ändar FLAG (Brown)-GFP (grönt), medan pMOD 4-galK-GT består av galK kassett flankerad av både FLAG-GFP homologi regioner och 50 nukleotid regioner identisk med 5 "och 3" ändarna av N-terminalen och C-terminala TAP (blå och orange, respektive). pMOD4-FLAG-GFP består av hela GFP kassett med en 5 "FLAG tagg och pLoxP UNC-119 består av UNC-119 genomisk sekvens (lila) i en plasmid som innehåller en loxP webbplats. Alla plasmider utnyttja R6K-baserade pMOD4 (röd) ryggrad som inte kan replikera i SW106.
Figur 2.
Översikt över galK recombineering process
Figur 2A-2C Separata siffror som visar stegen och den tid som recombineering med galK kassetten. Dessa är samma siffror som slås samman i figur 2d, men anges separat för tydlighet och underlätta läsningen. En fosmid av intresse är först ändras på ett förfarande i två steg som omfattar införandet av galK kassetten flankeras av 50 bp regioner homologi till flagg GFP eller TAP (Figur 2A) följt av byte av denna kassett i flagg-GFP eller TAP ( Figur 2B). Senare UNC-119 markör för alstring av transgena djur sätts i LoxP plats på fosmid stamnätet (figur 2C).
Figur 2D visar en sammanslagen siffra på galK recombineering förfarande.
Sammanfattning av galK recombineering som beskrivs i ovanstående inklusive tid som krävs för varje steg av sammanslagningen Figur 2A-2C.
Figur 2a. Den galk införande i galk recombineering.
Figur 2b. TAG (GFP / TAP) införande i galk recombineering.
Figur 2c. Tillägget av UNC-119.
Figur 2d. Det sammanslagna översikt över galk recombineering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den generation av transgener från fosmids erbjuder förmånen att behålla alla de infödda promotorn element, varianter skarva och 3 'UTR reglerande element. Detta kan leda till byggandet av en transgen som är mer reflekterande av de infödda uttryck mönster, eller byggandet av en funktionell transgen när andra metoder misslyckas 5. Den resulterande transgener kan bära en mängd olika epitop taggar inklusive GFP eller en TAP tagg.
Byggandet av transgener omfattat tre steg som alla utförs i SW106 bakteriella fläcken 15. För det första är galK genen integrerad i den önskade platsen i fosmid ändras genom recombineering med en PCR-produkt bär galK flankeras av homologi armar komplement till målet fosmid. En förbättring vi utvecklat är integreringen av homologi regioner för antingen FLAG-GFP eller en TAP tagg i galK kassetten ger en enda uppsättning oligos som ska användas för första och andra steg fosmid modifiering och sänka kostnaderna för oligos. En ytterligare förenkling är att använda en R6K-baserad vektor, som inte kan replikera i SW106 bakteriestam och eliminerar behovet av att smälta den förälder vektor. För det andra är galK kassett ersätts med taggar såsom GFP eller TAP som sedan smält med genen av intresse på fosmid. Detta steg är mycket robust och många riktigt modifierad fosmids rutinmässigt erhålls. Slutligen är UNC-119 markör för generering av transgena maskarna läggs till fosmid. Detta skapar en markör i CIS och direkt kopplad till ändrade fosmid. UNC-119 markör är allmänt och kompatibel med både mikroinjektion och biolistic bombardemanget 17,21. Beskjutning är särskilt användbart som ett betydande antal transgena linjerna kan genereras av en enda rättegång och till och med oerfaren personal kan skapa transgena djur.
En viktig aspekt av detta protokoll är att använda en skakvattenbad inkubator för stegen värmechock under förberedelserna för SW106 behöriga celler. Vi fann att användningen av ett luft-inkubator kunde inte värma bakterieodling till 42 ° C även efter 30 minuter i shakern (visas inte). Vi försökte också nedsänkning av bakterier i ett vattenbad med suboptimala resultat (visas inte). En skakvattenbad kan köpas användas från ett antal företag om de inte redan finns i labbet.
Utöver införandet av GFP eller epitop taggar, har vi också börjat använda denna teknik för platsspecifika mutagenes av masken gener bedrivs fosmids (A. Ferguson och A. Fisher, opublicerad). Detta uppnåddes genom att använda ett enkel-strängat oligo innehåller förändringen flankeras av 50 räntepunkter uppströms och nedströms platsen för att ersätta den galK genen. Kombinationen av fosmid mutagenes kombination med användning av en gen knockout mutant kan ge in vivo-funktionen av särskild gen isoformer, domäner eller specifika aminosyror som skall fastställas. Ytterligare våra protokoll bort galK markören i slutet så det är möjligt att utföra ytterligare rundor av ändringar infoga ytterligare epitop taggar eller utföra mutagenes på ett taggat konstruktion.
Slutligen är det troligt att vissa av dessa reagenser kan användas i konstruktionen av ändrade alkoholkoncentrationerna eller fosmids genom labs inte använder maskar. Den pMOD4 galK-G och pMOD4 galK-GT gener har fortfarande kvar hela galK genen så tidigare publicerade oligos kan fortfarande användas för att förstärka galK genen 15. Detta kommer fortfarande att behålla fördelarna med att använda R6K replikering ursprung när det gäller att inte behöva smälta den förälder plasmid eller noggrant rena PCR-produkten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Lindsey Nash för att få hjälp med att utveckla tekniken. Detta arbete har finansierats av NIH bidrag AG028977 till ALF, ett pilotprojekt bidrag från University of Pittsburgh OAIC (AG024827) och medel frö från University of Pittsburgh.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FosmidMAX kit | Epicentre Biotechnologies | FMAX046 | |
| GoTaq | Promega Corp. | M7122 | |
| MOPS Media | TEKnova, Inc. | M2120 | |
| 0.132 M Potassium phosphate solution | TEKnova, Inc. | M2102 | |
| D-galactose | Sigma-Aldrich | G0750 | |
| 2-deoxygalactose | Sigma-Aldrich | D4407 | |
| Biotin | Sigma-Aldrich | B4639 | |
| Leucine | Sigma-Aldrich | L8000 | |
| NH4Cl | Sigma-Aldrich | A9434 | |
| Phusion DNA polymerase | New England Biolabs | F-530S | |
| MacConkey agar base | BD Biosciences | 281810 | |
| Arabinose | Sigma-Aldrich | A3131 | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C1919 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | S5136 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G2025 | |
| Bacto Agar | BD Biosciences | 214010 |
References
- Mello, C., Fire, A.
- Zhang, Y., Nash, L., Fisher, A. L. A simplified, robust, and streamlined procedure for the production of C. elegans transgenes via recombineering. BMC Dev Biol. 8, 119-119 (2008).
- Antebi, A., Yeh, W. H., Tait, D., Hedgecock, E. M., Riddle, D. L. daf-12 encodes a nuclear receptor that regulates the dauer diapause and developmental age in C. elegans. Genes and Development. 14, 1512-1527 (2000).
- Snow, M. I., Larsen, P. L. Structure and expression of daf-12: a nuclear hormone receptor with three isoforms that are involved in development and aging in Caenorhabditis elegans. Biochim. Biophys. Acta. 1494, 104-116 (2000).
- Fisher, A. L., Page, K. E., Lithgow, G. J., Nash, L. The Caenorhabditis elegans K10C2.4 Gene Encodes a Member of the Fumarylacetoacetate Hydrolase Family. A CAENORHABDITIS ELEGANS MODEL OF TYPE I TYROSINEMIA. J Biol.Chem. 283, 9127-9135 (2008).
- Wightman, B., Ha, I., Ruvkun, G. Posttranscriptional regulation of the heterochronic gene lin-14 by lin-4 mediates temporal pattern formation in C. elegans. Cell. 75, 855-862 (1993).
- Lehrbach, N. J. LIN-28 and the poly(U) polymerase PUP-2 regulate let-7 microRNA processing in Caenorhabditis elegans. Nat Struct Mol Biol. 16, 1016-1020 (2009).
- Tursun, B., Cochella, L., Carrera, I., Hobert, O. A toolkit and robust pipeline for the generation of fosmid-based reporter genes in C. elegans. PLoS One. 4, e4625-e4625 (2009).
- Bamps, S., Hope, I. A. Large-scale gene expression pattern analysis, in situ, in Caenorhabditis elegans. Brief. Funct. Genomic. Proteomic. , (2008).
- Dolphin, C. T., Hope, I. A. Caenorhabditis elegans reporter fusion genes generated by seamless modification of large genomic DNA clones. Nucleic Acids Res. 34, e72-e72 (2006).
- Sarov, M. A recombineering pipeline for functional genomics applied to Caenorhabditis elegans. Nat. Methods. 3, 839-844 (2006).
- Yang, X. W., Model, P., Heintz, N. Homologous recombination based modification in Escherichia coli and germline transmission in transgenic mice of a bacterial artificial chromosome. Nat Biotechnol. 15, 859-865 (1997).
- Court, D. L., Sawitzke, J. A., Thomason, L. C. Genetic engineering using homologous recombination. Annu.Rev.Genet. 36, 361-388 (2002).
- Westenberg, M., Bamps, S., Soedling, H., Hope, I. A., Dolphin, C. T. Escherichia coli MW005: lambda Red-mediated recombineering and copy-number induction of oriV-equipped constructs in a single host. BMC Biotechnol. 10, 27-27 (2010).
- Warming, S., Costantino, N., Court, D. L., Jenkins, N. A., Copeland, N. G. Simple and highly efficient BAC recombineering using galK selection. Nucleic Acids Res. 33, e36-e36 (2005).
- Penfold, R. J., Pemberton, J. M. An improved suicide vector for construction of chromosomal insertion mutations in bacteria. Gene. 118, 145-146 (1992).
- Praitis, V., Casey, E., Collar, D., Austin, J. Creation of low-copy integrated transgenic lines in Caenorhabditis elegans. Genetics. 157, 1217-1226 (2001).
- Puig, O. The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification. Methods. 24, 218-229 (2001).
- Rigaut, G. A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration. Nat.Biotechnol. 17, 1030-1032 (1999).
- Achilleos, A., Wehman, A. M., Nance, J. PAR-3 mediates the initial clustering and apical localization of junction and polarity proteins during C. elegans intestinal epithelial cell polarization. Development. 137, 1833-1842 (2010).
- Maduro, M., Pilgrim, D. Identification and cloning of unc-119, a gene expressed in the Caenorhabditis elegans nervous system. Genetics. 141, 977-988 (1995).
