Summary
Oligonucleotides साइट के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है विशेष रूप से दोनों में ट्रांसफ़ेक्ट लक्ष्य जीन की एक एकल nucleotide विकल्प
Abstract
प्लाज्मोडियम परजीवी, मलेरिया की प्रेरणा का एजेंट, संक्रमित एनोफ़ेलीज़ हर साल 250 से अधिक मिलियन नए संक्रमण में जिसके परिणामस्वरूप मच्छरों के काटने के माध्यम से प्रेषित कर रहे हैं. अनुसंधान के दशकों के बावजूद, वहाँ अभी भी मलेरिया के खिलाफ कोई टीका नहीं है, उपन्यास नियंत्रण रणनीति के लिए की जरूरत पर प्रकाश डाला. आनुवंशिक रूप से संशोधित मच्छरों की एक नवीन दृष्टिकोण का उपयोग करने के लिए प्रभावी ढंग से मलेरिया परजीवी संचरण नियंत्रण है. मच्छर में सेल संकेत दे रास्ते की जानबूझकर लक्षित mutagenesis के माध्यम से, परिवर्तन, परजीवी के विकास को विनियमित 1 करने के लिए पाया गया है. इन अध्ययनों से हम परिवर्तन के लिए संभावित जीन लक्ष्यों की पहचान शुरू कर सकते हैं. लक्षित mutagenesis के पारंपरिक रूप से एक लक्ष्य जीन और एक बड़े डीएनए अणु के बीच मुताबिक़ पुनर्संयोजन पर भरोसा है. हालांकि, निर्माण और stably तब्दील सेल लाइनों की पीढ़ी के लिए ऐसी जटिल डीएनए अणु के उपयोग महंगा, समय लेने वाली और अक्सर अक्षम है. इसलिए, एक रणनीति का उपयोग बंद न्यूक्लिक एसिड संशोधित oligonucleotides (LNA-ons) episomal और गुणसूत्र डीएनए जीन लक्ष्य (2 में समीक्षा) में कृत्रिम एकल nucleotide substitutions के शुरू करने के लिए एक उपयोगी विकल्प प्रदान करता है. LNA पर मध्यस्थता लक्षित mutagenesis के दोनों खमीर और 3,4 चूहों के सभ्य कोशिकाओं में ब्याज की जीन में बिंदु उत्परिवर्तन परिचय करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. हम यहाँ दिखाने के लिए कि LNA-ons एक ट्रांसफ़ेक्ट episomal लक्ष्य में एक एकल nucleotide परिवर्तन है कि नीले फ्लोरोसेंट प्रोटीन अभिव्यक्ति (BFP) से दोनों एनोफ़ेलीज़ gambiae और एनोफ़ेलीज़ stephensi कोशिकाओं में हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन की अभिव्यक्ति (GFP) के लिए स्विच में परिणाम परिचय के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है . यह पहली बार है कि मच्छर की कोशिकाओं में लक्ष्य जीन की प्रभावी mutagenesis LNA-ons द्वारा मध्यस्थता हो सकता है और पता चलता है कि इस तकनीक इन विट्रो में और vivo में गुणसूत्र लक्ष्य के mutagenesis के लिए लागू किया जा सकता है के लिए रूपांतरण को दर्शाता है.
Protocol
- प्रोटोकॉल शुरू करने से पहले, यह निर्धारित करने के लिए महत्वपूर्ण है कि मच्छर प्रयोग में इस्तेमाल किया कोशिकाओं को स्वस्थ हैं और ~ 80% संगम पर अगर अनुयायी (चित्रा 1). ऊंचा हो गया या अस्वस्थ कोशिकाओं को कम अभिकर्मक दक्षता में परिणाम और असंगत परिणाम देना होगा.
- सभी मीडिया से पहले गर्म करने के लिए 30 मिनट के लिए एक 28 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में उपयोग.
- सदस्य, है Earle w / glutamine, 5% गर्मी निष्क्रिय FCS, 0.2% D शर्करा, 1% एंटीबायोटिक पेनिसिलिन - स्ट्रेप्टोमाइसिन, और 1% गैर आवश्यक अमीनो एसिड: ए stephensi MSQ43 कोशिकाओं E5 माध्यम की आवश्यकता है.
- ए gambiae SUA5B कोशिकाओं S2 माध्यम की आवश्यकता होती है Schneider ड्रोसोफिला मध्यम, 5% गर्मी निष्क्रिय FCS, और 1% एंटीबायोटिक पेनिसिलिन - स्ट्रेप्टोमाइसिन:
- पहले गला लें, और बर्फ पर सभी अभिकर्मक अभिकर्मक सामग्री, plasmids, और oligonucleotides की दुकान.
- बाँझ तकनीक का उपयोग कर एक टिशू कल्चर हुड में सभी प्रक्रियाओं बाहर किया जाना चाहिए.
- पक्षपाती कोशिकाओं (ए gambiae SUA5B ए stephensi MSQ43) कोशिकाओं को परेशान बिना बंद पुराने मीडिया aspirate, ताजा मीडिया के एक बराबर मात्रा है कि 28 के लिए गरम जोड़ने ° सी, और तब बंद के नीचे से कोशिकाओं कुल्ला एक कुप्पी का उपयोग विंदुक.
- कक्षों की एकाग्रता और निर्धारित किया जाना चाहिए 1x10 6 कोशिकाओं / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता को समायोजित. कक्ष कमरे के तापमान पर रखा जा सकता है है जबकि अभिकर्मक अभिकर्मक सामग्री की तैयारी.
- 6 अच्छी तरह से एक थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए मच्छर कोशिकाओं (1x10 6 कोशिकाओं / एमएल) की 1 एमएल जोड़ें. प्रत्येक प्रयोगात्मक हालत (नीचे देखें) के लिए एक थाली सेट.
टेबल मैं एक सामान्य अभिकर्मक के लिए एक pipetting योजना है. तालिका II पांच के लिए एक एकल nucleotide BFP विशेष LNA-ons का उपयोग सफल mutagenesis के लिए परीक्षण की स्थिति की रूपरेखा. पहले दो, pGFP और pBFP, सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण क्रमशः रहे हैं,. शेष BFP विशेष LNA-ons की बढ़ती सांद्रता के साथ pBFPs के प्रयोगात्मक शर्तों रहे हैं. 12 के माध्यम से चरण 8 में, अभिकर्मक की उचित मात्रा तदनुसार प्रत्येक शर्त जोड़ने के लिए. - एक बाँझ 1.5 एमएल microcentrifuge ट्यूब प्लास्मिड डीएनए स्थानांतरण और चुनाव आयोग बफर की उचित मात्रा में जोड़ने.
- 1 μL प्लाज्मिड डीएनए (1 μg / μL) के लिए चुनाव आयोग बफर के 99 μL जोड़ें.
- 1 μL pGFP (1μg / μL) के लिए चुनाव आयोग बफर के 99 μL जोड़ें.
- 1 μL pBFP (1μg / μL) के लिए चुनाव आयोग बफर के 99 μL जोड़ें.
- 1 μL pBFP (1μg / μL) और 1 पर μL (μg / μL) के लिए चुनाव आयोग बफर के 98 μL जोड़ें.
- 1 μL pBFP (1μg / μL) और 5 पर μL (1μg / μL) के लिए चुनाव आयोग बफर के 94 μL जोड़ें.
- 1 μL pBFP (1μg / μL) और 10 पर μL (1μg / μL) के लिए चुनाव आयोग बफर के 89 μL जोड़ें.
- फिर धीरे धीरे इस्तेमाल किया डीएनए के एक μg प्रति बढ़ाने जोड़ने.
- 1 μL प्लास्मिड डीएनए के लिए, 8 μL बढ़ाने जोड़ें.
- 1 μL pGFP के लिए, 8 μL बढ़ाने जोड़ें.
- 1 μL pBFP के लिए, 8 μL बढ़ाने जोड़ें.
- 1 μL pBFP और एक μL के लिए, 16 μL बढ़ाने जोड़ें.
- 1 μL pBFP और 5 μL के लिए, 48 μL बढ़ाने जोड़ें.
- 1 μL pBFP और 10 μL के लिए, 88 μL बढ़ाने जोड़ें.
- भंवर डीएनए / / बफर बढ़ाने 1 सेकंड और सुनिश्चित करें कि समाधान के सभी ट्यूब के नीचे है के लिए मिश्रण. फिर 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं.
- 1 μg प्लाज्मिड और 10 सेकंड के लिए डीएनए भंवर प्रति Effectene अभिकर्मक जोड़ें. पुष्टि करें कि समाधान के सभी ट्यूब के नीचे है और फिर 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं.
- 1 μL प्लास्मिड डीएनए के लिए, 10 μL Effectene (टेबल मैं) जोड़ सकते हैं.
- 1 μL pGFP के लिए, 10 μL Effectene (तालिका II) जोड़ें.
- 1 μL pBFP के लिए, 10 μL Effectene (तालिका II) जोड़ें.
- 1 μL pBFP और एक μL के लिए, 20 μL Effectene (तालिका II) जोड़ें.
- 1 μL pBFP और 5 μL के लिए, 60 μL Effectene (तालिका II) जोड़ें.
- 1 μL pBFP और 10 μL के लिए, 110 μL Effectene (तालिका II) जोड़ें.
- 1000 μL के अंतिम मात्रा में गरम मिश्रण डीएनए बफर / / / बढ़ाने Effectene dropwise मीडिया जोड़कर प्रत्येक ट्यूब लाओ. डीएनए कर सकते हैं इस बिंदु पर वेग अगर मीडिया भी जल्दी से जोड़ा जाता है. धीरे ऊपर और नीचे pipetting 3-4 बार मिश्रण.
- 1 μL प्लास्मिड डीएनए के लिए, 882 μL मीडिया (तालिका मैं) जोड़ सकते हैं.
- 1 μL pGFP के लिए, 882 μL मीडिया (तालिका II) जोड़ें.
- 1 μL pBFP के लिए, 882 μL मीडिया (तालिका II) जोड़ें.
- 1 μL pBFP और एक μL के लिए, 864 μL मीडिया (तालिका II) जोड़ें.
- 1 μL pBFP और 5 μL के लिए, 792 μL मीडिया (तालिका II) जोड़ें.
- 1 μL pBFP और 10 μL के लिए, 702 μL मीडिया (तालिका II) जोड़ें.
- अगले धीरे अच्छी तरह से एक समय में एक बूंद प्रत्येक उचित मिश्रण डीएनए / / बढ़ाने Effectene के 1 एमएल जोड़ने.
- भंवर थाली धीरे अभिकर्मक और मिश्रण कोशिकाओं के समान वितरण सुनिश्चित करने के लिए. Incubatसामान्य विकास शर्तों के तहत ई कोशिकाओं.
- अभिकर्मक के बाद एक दिन, धीरे से बाहर मीडिया aspirate और धीरे धीरे हौसले गरम मीडिया के एक बराबर मात्रा के साथ की जगह. यह महत्वपूर्ण है कुओं के नीचे परेशान करने के लिए नहीं सेल परतों जब यह कर रहे हैं.
- अभिकर्मक के बाद दो दिनों सकारात्मक नियंत्रण फ्लोरोसेंट करने के लिए अभिकर्मक दक्षता (चित्रा 2) निर्धारित खुर्दबीन के नीचे pGFP साथ ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं की जांच.
- SUA5B कोशिकाओं को बहुत जल्दी बढ़ने और ऊंचा हो जाएगा. चार अभिकर्मक बाहर aspirating पुराना मीडिया और धीरे हौसले गरम मीडिया के एक बराबर मात्रा जोड़ने के द्वारा पतली इन कोशिकाओं के बाद दिन.
- कुओं के लिए नए मीडिया को जोड़ने के बाद, pipeting प्रत्येक अच्छी तरह से नीचे से सभी कोशिकाओं को अलग और नीचे, सेल के मिश्रण का आधा आयतन (1 एमएल) त्यागें और ताजा गरम मीडिया के 1 एमएल जोड़ने के लिए 2 से अंतिम मात्रा लाने एमएल.
- कोशिकाओं दैनिक जाँच के लिए यकीन है कि वे स्वस्थ और ऊंचा हो गया नहीं हैं, आवश्यक के रूप में में पतली.
- कोशिकाओं को सामान्य परिस्थितियों के तहत पांच से सात दिनों के बाद अभिकर्मक के लिए विश्लेषण के लिए उन्हें इकट्ठा करने से पहले विकसित करने के लिए अनुमति दें.
- पांच से सात दिनों के बाद अभिकर्मक, बंद aspirating सभी कुओं में पुराने मीडिया और हर अच्छी तरह से बाँझ कमरे के तापमान पीबीएस के 1 एमएल जोड़ने से कोशिकाओं को इकट्ठा.
- ऊपर और नीचे pipetting द्वारा अच्छी तरह से नीचे से कोशिकाओं को अलग और 5 एमएल तस्वीर टोपी ट्यूबों सेल मिश्रण हस्तांतरण और तुरंत cytometry प्रवाह के माध्यम से कोशिकाओं का विश्लेषण.
प्रतिनिधि परिणाम
चित्रा 1 Untransfected स्वस्थ ए. stephensi MSQ43 (ए) और ए. लगभग 80% संगम पर gambiae SUA5B कोशिकाओं (बी).
चित्रा 2 ए. stephensi MSQ43 (ए) और ए. gambiae SUA5B कोशिकाओं (बी) सकारात्मक नियंत्रण प्लाज्मिड व्यक्त GFP साथ ट्रांसफ़ेक्ट.
चित्रा 3. प्रवाह cytometry GFP BFP बंद - विशिष्ट nucleic एसिड संशोधित oligonucleotides (LNA-ons) के साथ एक एकल nucleotide निम्नलिखित अभिकर्मक के mutagenesis के माध्यम से BFP के रूपांतरण की पुष्टि डेटा. सकारात्मक नियंत्रण के रूप में एक प्लाज्मिड व्यक्त GFP (pGFP) के साथ SUA5B कोशिकाओं ट्रांसफ़ेक्ट थे, एक एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में प्लास्मिड (pBFP) व्यक्त BFP के साथ, या pBFP और BFP विशेष LNA-ons की बढ़ती सांद्रता के साथ. (ए) प्रवाह cytometry बाएँ से दाएँ दिखा डेटा के लिए Gating रणनीति: जीवित कोशिकाओं, propidium आयोडाइड (पीआई) नकारात्मक कोशिकाओं, और GFP पांच दिन अभिकर्मक निम्नलिखित सकारात्मक कोशिकाओं के आगे बनाम ओर तितर बितर. (बी) GFP सकारात्मक कोशिकाओं के प्रतिशत का ग्राफ़ (ए) pBFP और LNA-ons की बढ़ती सांद्रता के साथ निम्नलिखित अभिकर्मक में दिखाया गया है.
टेबल मैं अभिकर्मक शर्तों.
टेबल द्वितीय अभिकर्मक शर्तों चित्र 1 में इस्तेमाल किया.
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Discussion
यहाँ हम इन विट्रो विधि और सबूत लक्षित रूपांतरण के लिए एक episomal जीन लक्ष्य में एक एकल nucleotide के LNA-ons - ए में अभिकर्मक के बाद में एक वर्तमान stephensi और ए gambiae कोशिकाओं. LNA पर की मध्यस्थता जीन रूपांतरण एक साइट विशिष्ट डीएनए की मरम्मत प्रतिक्रिया की प्रेरण की आवश्यकता है, हमारे आंकड़ों से संकेत मिलता है कि मच्छर कोशिकाओं साइट विशिष्ट mutagenesis के लिए इस तंत्र का समर्थन कर सकते हैं. जबकि विधि यहाँ प्रस्तुत एक episomal लक्ष्य के रूपांतरण पर आधारित है, हमारे आंकड़े बताते हैं कि LNA पर मध्यस्थता रूपांतरण मच्छर कोशिकाओं में गुणसूत्र लक्ष्यों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है के रूप में यह अन्य प्रणालियों में किया गया है. जीन रूपांतरण, इसलिए जटिल प्रोटोकॉल और लंबा दवा चयन शासनों के बिना stably तब्दील मच्छर सेल लाइनों की पीढ़ी सुविधा होगी. इसके अलावा, मौजूदा प्रौद्योगिकी के उपयोग पर आधारित mRNA - विशिष्ट जीवित कोशिकाओं में फ्लोरोसेंट टैग सॉर्ट और जैविक 5-7 अध्ययन के लिए परिवर्तित गुणसूत्र जीन लक्ष्य के साथ मच्छर कोशिकाओं को समृद्ध करने के लिए leveraged किया जा सकता है.
इस विधि की सफलता समीक्षकों 70-80% की एक घनत्व में स्वस्थ कोशिकाओं के उपयोग पर निर्भर करता है. इसके अलावा, हर कदम पर अभिकर्मक प्रक्रिया के दौरान यह महत्वपूर्ण है निर्धारित करने के लिए है कि न तो प्लाज्मिड और न ही LNA के ons समाधान के समाधान के वेग के लिए नेत्रहीन जाँच से उपजी है. थाली करने के लिए इस प्रोटोकॉल के एक संशोधन संभव है कोशिकाओं 24 घंटे पहले अभिकर्मक प्रक्रिया शुरू करने के लिए. यह धीमी गति से बढ़ रही है या संवेदनशील सेल लाइनों के लिए सुझाव दिया है. हमने पाया है कि LNA-ons प्लास्मिड डीएनए के इष्टतम अनुपात 01:05 था, लेकिन यह महत्वपूर्ण हो करने के लिए प्रत्येक नए जीन और ब्याज की सेल लाइन के लिए आदर्श अनुपात का निर्धारण करेगा.
अध्ययन की एक किस्म मच्छर loci और जीन है कि मलेरिया परजीवी संक्रमण 8-10 के लिए प्रतिरोध प्रदान की पहचान की है . यदि इन लक्ष्यों हेरफेर करने के लिए उत्तरदायी कर रहे हैं - की वृद्धि या अभिव्यक्ति समय के पुनर्निर्देशन के माध्यम से - वे प्राकृतिक सदिश आबादी में मलेरिया परजीवी संचरण नियंत्रण रणनीति के रूप में जेनेटिक इंजीनियरिंग के लिए एक आधार प्रदान कर सकते हैं. यहाँ पर चर्चा की पद्धति प्रयोगशाला में मलेरिया प्रतिरोध जीनों में म्यूटेशनों शुरू करने के लिए एक उपन्यास और प्रभावी तकनीक है. हित के जीन की इन जोड़तोड़ के माध्यम से, हम विशेष रूप से निर्धारित कैसे जीन उत्पादों इन विट्रो, vivo में मलेरिया परजीवी के विकास की समझ को नियंत्रित करने के लिए एक महत्वपूर्ण कदम में सेलुलर विरोधी परजीवी प्रतिक्रियाओं में परिवर्तन कर सकते हैं.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
हम कैलिफोर्निया cytometry प्रवाह के साथ उसे सहायता के लिए नेशनल प्राइमेट रिसर्च सेंटर में Abbie स्पिनर धन्यवाद देना चाहूंगा. इस अध्ययन एलर्जी और संक्रामक रोगों के राष्ट्रीय संस्थान (NIAID) के राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (एनआईएच) AI073745, AI080799, और AI078183 से धन के द्वारा समर्थित किया गया था.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Effectene transfection reagent | Qiagen | 301425 | |
| GFP control plasmid (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-neg) | Invitrogen | K4935-00 | |
| BFP plasmid (pcDNA5/FRT/TO) | Gift from Dr. Concordet3 | ||
| LNA-ONs | Gift from Dr. Concordet3 | ||
| MEM, Earle’s w/ glutamine | Invitrogen | 11095 | |
| Fetal calf serum (FCS) | Invitrogen | 16000 | |
| Schneider’s Drosophila medium | Invitrogen | 11730 | |
| Non-essential amino acids | Invitrogen | 11140 | |
| 10% D-glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | |
| Penicillin-streptomycin antibiotic | Invitrogen | 15140 | |
| 6-well culture plates | Corning | 3516 |
References
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