Summary
Oligonucleótidos se puede utilizar para sustituir a un sitio concreto de un solo nucleótido de los genes diana transfectadas en ambos
Abstract
Parásitos Plasmodium, el agente causante de la malaria, se transmite por la picadura de mosquitos anofeles infectados que resulta en más de 250 millones de nuevas infecciones cada año. A pesar de décadas de investigación, aún no existe una vacuna contra la malaria, destacando la necesidad de estrategias de control de la novela. Un enfoque innovador es el uso de mosquitos genéticamente modificados para controlar de forma efectiva la transmisión de parásitos de malaria. Alteraciones deliberadas de vías de señalización celular en el mosquito, a través de mutagénesis dirigida, se han encontrado para regular el desarrollo del parásito 1. A partir de estos estudios, podemos empezar a identificar posibles objetivos para la transformación genética. Mutagénesis dirigida se ha basado tradicionalmente en la recombinación homóloga entre un gen diana y una molécula de ADN de gran tamaño. Sin embargo, la construcción y el uso de tales moléculas de ADN complejo para la generación de líneas celulares transformadas de forma estable es costoso, lento y con frecuencia ineficientes. Por lo tanto, una estrategia de uso de ácido nucleico cerrado modificado-oligonucleótidos (LNA-ons) ofrece una alternativa útil para la introducción artificial sustituciones de un solo nucleótido en el gen episomal objetivos y ADN cromosómico (revisado en 2). LNA-ON mediada por mutagénesis dirigida se ha utilizado para introducir mutaciones puntuales en genes de interés en cultivos de células de levadura y 3,4 ratones. Mostramos aquí que LNA complementos pueden ser utilizados para introducir un cambio de nucleótido único en un objetivo episomal transfectadas que se traduce en un cambio de la proteína fluorescente azul (BFP) expresión de la proteína verde fluorescente (GFP) de expresión, tanto en Anopheles gambiae y Anopheles stephensi células . Esta conversión se demuestra por primera vez que la mutagénesis eficaz de los genes diana en las células de mosquito puede estar mediado por LNA-ons y sugiere que esta técnica puede ser aplicable a la mutagénesis de los objetivos cromosómicas in vitro e in vivo.
Protocol
- Antes de iniciar el protocolo, es importante para determinar que las células de mosquito utilizados en el experimento son saludables y en la confluencia ~ 80% si el tratamiento (Figura 1). Células cubierto o insalubres se traducirá en la eficiencia de transfección de baja y le dará los resultados inconsistentes.
- Calentar todos los medios de comunicación antes de su uso en un baño de agua de 28 ° C durante 30 minutos.
- A. stephensi MSQ43 células requieren E5 medio: MEM, w Earle / glutamina, 5% de FCS inactivado por calor, el 0,2% de D-glucosa, 1% de penicilina-estreptomicina, y el 1% no aminoácidos esenciales.
- A. gambiae células SUA5B requieren S2 medio: Drosophila de Schneider medio, el 5% de FCS inactivado por calor, y el 1% de penicilina-estreptomicina antibiótico
- Descongelar y almacenar todos los materiales de reactivo de transfección, plásmidos y oligonucleótidos en el hielo.
- Todos los procedimientos deben llevarse a cabo en una campana de cultivo de tejidos utilizando una técnica estéril.
- Para células adherentes (A. gambiae SUA5B, A. stephensi MSQ43) aspirado de los viejos medios sin molestar a las células, añadir un volumen equivalente de medio fresco que se ha calentado a 28 ° C, y luego enjuague las células de la parte inferior de la frasco con una pipeta.
- La concentración de células debe ser determinada y ajustada a una concentración final de 1x10 6 células / ml. Las células se pueden mantener a temperatura ambiente, mientras que la preparación de materiales de transfección reactivo.
- Añadir 1 ml de células de mosquito (1x10 6 células / ml) a cada pocillo de una placa de 6 pocillos. Establecer un plato para cada condición experimental (ver más abajo).
La tabla I es un sistema de pipeteo para una transfección general. La Tabla II resume cinco condiciones para la prueba de mutagénesis con éxito de un solo nucleótido con BFP específicos LNA-ons. Los dos primeros, y pGFP pBFP, son los controles positivos y negativos, respectivamente. El resto son condiciones experimentales de pBFPs con concentraciones crecientes de BFP específicos LNA-ons. En los pasos 8 a 12, añadir un volumen adecuado de reactivo en consecuencia para cada condición. - La transferencia de ADN plásmido a un tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 ml y agregar el volumen apropiado de tampón de la CE.
- Para un ADN plásmido l (1 mg / l), añadir 99 l de tampón CE.
- Por un pGFP l (1 g / l), añadir 99 l de tampón CE.
- Por un pBFP l (1 g / l), añadir 99 l de tampón CE.
- Por un pBFP l (1 g / l) y una l ON (mg / l), añadir 98 l de tampón CE.
- Por un pBFP l (1 g / l) y 5 l ON (1 g / l), añadir 94 l de tampón CE.
- Por un pBFP l (1 g / l) y 10 l ON (1 g / l), añadir 89 l de tampón CE.
- Luego agregue lentamente reforzador por 1 mg de ADN utilizado.
- Por un plásmido de ADN l, añadir 8 l Enhancer.
- Por un pGFP l, añadir 8 l Enhancer.
- Por un pBFP l, añadir 8 l Enhancer.
- Por un pBFP l y l 1 ON, añadir 16 l Enhancer.
- Por un pBFP l y l 5 ON, añadir 48 l Enhancer.
- Por un pBFP l l 10 y ON, añadir 88 l Enhancer.
- Vortex ADN / buffer / Enhancer mezcla durante 1 segundo y asegúrese de que toda la solución está en la parte inferior del tubo. A continuación, se incuba a temperatura ambiente durante 5 min.
- Añadir el reactivo Effectene por ADN plásmido 1 mg y agite por 10 segundos. Compruebe que toda la solución está en el fondo del tubo y luego se incuban a temperatura ambiente durante 10 min.
- Por un plásmido de ADN l, añadir 10 Effectene l (Tabla I).
- Por un pGFP l, añadir 10 Effectene l (Tabla II).
- Por un pBFP l, añadir 10 Effectene l (Tabla II).
- Por un pBFP l y l 1 ON, añadir 20 Effectene l (Tabla II).
- Por un pBFP l y l 5 ON, añadir 60 Effectene l (Tabla II).
- Por un pBFP l l 10 y ON, añadir 110 Effectene l (Tabla II).
- Llevar a cada tubo a un volumen final de 1000 l mediante la adición de los medios de comunicación calentado gota a gota a la mezcla de ADN / buffer / Enhancer / Effectene. ADN puede precipitar en este momento si los medios de comunicación se añade demasiado rápido. Mezclar suavemente con la pipeta hacia arriba y abajo 3-4 veces.
- Por un plásmido de ADN l, añadir los medios de comunicación 882 l (tabla I).
- Por un pGFP l, añadir los medios de comunicación 882 l (Tabla II).
- Por un pBFP l, añadir los medios de comunicación 882 l (Tabla II).
- Por un pBFP l y l 1 ON, añadir 864 medios de comunicación l (Tabla II).
- Por un pBFP l y l 5 ON, añadir 792 medios de comunicación l (Tabla II).
- Por un pBFP l l 10 y ON, añadir los medios de comunicación 702 l (Tabla II).
- A continuación se añade lentamente 1 ml de la correspondiente ADN / Enhancer / Effectene mezcla a cada pocillo una gota a la vez.
- Agitar la placa suavemente para asegurar la distribución uniforme de las células y la mezcla de transfección. Incubatlas células e bajo condiciones normales de crecimiento.
- Un día después de la transfección, suavemente aspire a sustituir a los medios de comunicación y poco a poco, con un volumen equivalente de los medios de comunicación recién calentado. Es importante no perturbar las capas de células en la parte inferior de los pozos cuando se hace esto.
- Dos días después de la transfección examinar las células positivas de control transfectadas con pGFP bajo microscopio de fluorescencia para determinar la eficiencia de transfección (Figura 2).
- SUA5B células crecen muy rápidamente y se convertirá en maleza. Cuatro días después de la transfección de estas células delgadas aspirando a los medios de comunicación antiguos y agregar poco a poco un volumen equivalente de los medios de comunicación recién calentado.
- Después de la adición de nuevos medios de comunicación a los pozos, desmonte todas las células de la parte inferior de cada pozo pipeta de arriba a abajo, descartar la mitad del volumen (1 ml) de la mezcla de células y agregar 1 ml de agua dulce caliente medios para llevar el volumen final a 2 mL.
- Revisar las células diariamente para asegurarse de que están sanos y no cubierto, fina como sea necesario.
- Permiten que las células crezcan en condiciones normales de cinco a siete días antes de la transfección a su recogida para su análisis.
- De cinco a siete días después de la transfección, recoger las células mediante la aspiración de los viejos medios en todos los pozos y la adición de 1 ml de PBS estéril a temperatura ambiente a cada pocillo.
- Separar las células de la parte inferior del pozo pipeteando arriba y hacia abajo y la transferencia de mezcla de células de 5 tubos con tapa de presión ml y de inmediato analizar las células mediante citometría de flujo.
Resultados representante
Figura 1. A. untransfected saludable stephensi MSQ43 (A) y A. gambiae SUA5B (B) las células en la confluencia de aproximadamente 80%.
Figura 2. A. stephensi MSQ43 (A) y A. gambiae SUA5B (B) las células transfectadas con GFP control positivo expresar plásmido.
Figura 3. Citometría de flujo de datos que confirma la conversión de BFP a las buenas prácticas agrarias a través de la mutagénesis de un solo nucleótido siguientes transfección con BFP específicas de ácido nucleico cerrado-oligonucleótidos modificados (LNA-ons). SUA5B células fueron transfectadas con un plásmido que expresa GFP (pGFP) como control positivo, con un plásmido que expresa BFP (pBFP) como control negativo, o con pBFP y concentraciones crecientes de BFP específicos LNA-ons. (A) de apertura de puerta estrategia para los datos de citometría de flujo que muestra de izquierda a derecha: dispersión frontal contra lado de las células vivas, yoduro de propidio (PI), las células negativas, y las células GFP positivos cinco días después de la transfección. (B) Gráfico de porcentaje de células positivas GFP se muestra en (A) transfección siguientes pBFP y concentraciones crecientes de LNA-ons.
Tabla I. condiciones de transfección.
Tabla II. Condiciones de transfección utilizado en la Figura 1.
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Discussion
Aquí presentamos un método in vitro y las pruebas para la conversión selectiva de un solo nucleótido en el gen episomal un objetivo después de la transfección de LNA-Ons en A. stephensi y A. gambiae células. LNA-ON mediada por la conversión de genes requiere la inducción de un sitio específico de la respuesta de reparación del ADN, nuestros datos indican que las células de mosquito puede apoyar este mecanismo de mutagénesis sitio-específica. Mientras que el método que aquí se presenta se basa en la conversión de un objetivo episomal, nuestros datos sugieren que la LNA-ON-mediada la conversión puede ser optimizado para los objetivos de los cromosomas en las células de mosquito como lo ha sido en otros sistemas. La conversión de genes, por lo tanto, facilitará la generación de transformadas de manera estable las líneas de células de mosquito sin protocolos complejos y largos regímenes de selección de medicamentos. Además, la tecnología actual basada en el uso de ARNm específicos de etiquetas fluorescentes en las células vivas se puede aprovechar para clasificar y enriquecer células de mosquito con objetivos convertido gen cromosómico de los estudios biológicos 7.5.
El éxito de este método depende fundamentalmente de la utilización de las células sanas, con una densidad de 70-80%. Además, en todos los pasos durante el proceso de transfección es importante para determinar que ninguno de los plásmidos ni ONs LNA-han precipitado de la solución mediante la comprobación visual de la solución para precipitar. Una posible modificación de este protocolo es la placa de las células 24 horas antes de comenzar el proceso de transfección. Esto se deduce de las líneas celulares de crecimiento lento o sensible. Se encontró que la proporción óptima de ADN de plásmido LNA-Ons fue 1:5, pero será importante para determinar la proporción ideal para cada nuevo gen y la línea celular de interés.
Una variedad de estudios han identificado loci de mosquitos y los genes que confieren resistencia a la malaria 8-10 infección parasitaria. Si estos objetivos se prestan a la manipulación - a través de la mejora de la redirección de la oportunidad de expresión - que pueden servir de base para la ingeniería genética como una estrategia para controlar la transmisión de parásitos de malaria en las poblaciones de vectores naturales. La metodología de debate aquí es una técnica novedosa y eficaz para la introducción de mutaciones en genes de resistencia a la malaria en el laboratorio. A través de estas manipulaciones de genes de interés, se puede determinar específicamente cómo los productos de genes celulares alteran las respuestas anti-parásito in vitro, un paso crítico para el control de la comprensión del desarrollo de parásito de la malaria en vivo.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Nos gustaría dar las gracias a Abbie Spinner en el Centro Nacional de Investigación de Primates de California por su ayuda con la citometría de flujo. Este estudio fue apoyado por fondos del Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas (NIAID), Institutos Nacionales de Salud (NIH) AI073745, AI080799 y AI078183.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Effectene transfection reagent | Qiagen | 301425 | |
| GFP control plasmid (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-neg) | Invitrogen | K4935-00 | |
| BFP plasmid (pcDNA5/FRT/TO) | Gift from Dr. Concordet3 | ||
| LNA-ONs | Gift from Dr. Concordet3 | ||
| MEM, Earle’s w/ glutamine | Invitrogen | 11095 | |
| Fetal calf serum (FCS) | Invitrogen | 16000 | |
| Schneider’s Drosophila medium | Invitrogen | 11730 | |
| Non-essential amino acids | Invitrogen | 11140 | |
| 10% D-glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | |
| Penicillin-streptomycin antibiotic | Invitrogen | 15140 | |
| 6-well culture plates | Corning | 3516 |
References
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