Summary
Олигонуклеотиды могут быть использованы для сайта специально заменой одного нуклеотида трансфицированных генов-мишеней в обоих
Abstract
Plasmodium паразитов, возбудителей малярии, которые передаются через укусы инфицированных комаров Anopheles в результате которых более 250 млн. новых случаев инфицирования ежегодно. Несмотря на десятилетия исследований, до сих пор нет вакцины против малярии, подчеркивая необходимость разработки стратегий роман контроля. Одним из новаторских подхода является использование генетически модифицированных комаров для эффективного контроля передачи малярии. Умышленные изменения клеточных сигнальных путей в организме комара, с помощью направленного мутагенеза, были обнаружены регулировать паразита развития 1. На основании этих исследований, мы можем начать определять потенциальные цели гена для трансформации. Целевые мутагенеза традиционно полагались на гомологичной рекомбинации между гена-мишени и большой молекулы ДНК. Тем не менее, строительство и использование таких сложных молекул ДНК для генерации стабильно трансформированные клеточные линии стоит дорого, отнимает много времени и часто неэффективны. Таким образом, стратегию, используя заблокирован нуклеиновых кислот-модифицированных олигонуклеотидов (LNA дополнений) обеспечивает полезную альтернативу для введения искусственного одиночных нуклеотидных замен в эписомной и хромосомной ДНК гена целями (см. обзор 2). МШУ-НА-опосредованной направленного мутагенеза были использованы для введения точечных мутаций в генах интереса к культуре клеток, так дрожжей и мышей 3,4. Мы покажем здесь, что LNA дополнений может быть использован для внедрения одного нуклеотида изменение трансфицированных эписомной цель, которая приводит к переключаться с синим флуоресцентным белком (ПСБ) выражение на зеленый флуоресцентный белок (GFP) выражение в обеих Anopheles gambiae и Anopheles stephensi клетки . Это преобразование демонстрирует в первый раз, что эффективное мутагенеза генов-мишеней в комара клетки могут быть опосредованы LNA дополнений и предполагает, что этот метод может быть применим к мутагенеза хромосомных цели в пробирке и в естественных условиях.
Protocol
- До начала протокола, важно определить, что комар клетки, используемые в эксперименте, были здоровы и на ~ 80% слияния, если приверженец (рис. 1). Заросший или нездоровые клетки приведет к низкой эффективности трансфекции и дают противоречивые результаты.
- Разминка всех средствах массовой информации до использования в 28 ° С водяной бане в течение 30 минут.
- А. stephensi MSQ43 клетки требуют E5 среды: MEM, ш Эрла / глутамина, 5% тепла инактивированной ФТС, 0,2% D-глюкозы, 1% пенициллина стрептомицин антибиотик, и 1% без незаменимых аминокислот.
- А. gambiae SUA5B клетки требуют S2 среды: Шнайдера дрозофилы среду, 5% тепла инактивированной ФТС, и 1% пенициллина стрептомицин антибиотик
- Оттепель и хранить все трансфекции реагента материалы, плазмиды, и олигонуклеотидов на льду.
- Все процедуры должны выполняться в капюшоне культуры тканей с использованием стерильной техники.
- Для прилипшие клетки (А. gambiae SUA5B, А. stephensi MSQ43) аспирата старые средства массовой информации, не нарушая клеток, добавить эквивалентный объем свежих средств массовой информации, который был нагревают до 28 ° C, а затем смыть клетки со дна колбу с помощью пипетки.
- Концентрации клеток должны быть определены и скорректированы с учетом конечной концентрации 1х10 6 кл / мл. Клетки могут храниться при комнатной температуре, при подготовке материалов трансфекции реагента.
- Добавить 1 мл комаров клетки (1х10 6 кл / мл) в каждую лунку 6-луночный планшет. Настройка пластина для каждого экспериментального условия (см. ниже).
Таблица I является пипетирования схема общего трансфекции. Таблица II выделяет пять условий для проверки успешного мутагенеза однонуклеотидных использованием BFP конкретных LNA дополнений. Первые два, pGFP и pBFP, положительные и отрицательные контроли, соответственно. Остальные являются экспериментальными условиями pBFPs с увеличением концентрации BFP конкретных LNA дополнений. В шаги с 8 по 12, добавить соответствующие объемы реагента, соответственно, для каждого условия. - Передача плазмидной ДНК в стерильном 1,5 трубки микроцентрифужных мл и добавить соответствующий объем буфера ЕС.
- За 1 мкл ДНК плазмиды (1 мкг / мкл), добавить 99 мкл буфера ЕС.
- За 1 мкл pGFP (1 мкг / мкл), добавить 99 мкл буфера ЕС.
- За 1 мкл pBFP (1 мкг / мкл), добавить 99 мкл буфера ЕС.
- За 1 мкл pBFP (1 мкг / мкл) и 1 мкл ON (мкг / мкл), добавить 98 мкл буфера ЕС.
- За 1 мкл pBFP (1 мкг / мкл) и 5 мкл ON (1 мкг / мкл), добавить 94 мкл буфера ЕС.
- За 1 мкл pBFP (1 мкг / мкл) и 10 мкл ON (1 мкг / мкл), добавить 89 мкл буфера ЕС.
- Затем постепенно добавить Enhancer на 1 мкг ДНК используется.
- За 1 мкл ДНК плазмиды, добавьте 8 мкл Enhancer.
- За 1 мкл pGFP, добавьте 8 мкл Enhancer.
- За 1 мкл pBFP, добавьте 8 мкл Enhancer.
- За 1 мкл pBFP и 1 мкл ON, добавить 16 мкл Enhancer.
- За 1 мкл pBFP и 5 мкл ON, добавить 48 мкл Enhancer.
- За 1 мкл pBFP и 10 мкл ON, добавить 88 мкл Enhancer.
- Vortex ДНК / буфер / Enhancer смесь в течение 1 секунды и убедитесь, что все решения в нижней части трубы. Затем инкубировать при комнатной температуре в течение 5 мин.
- Добавить Effectene реагента на 1 мкг ДНК плазмиды и вихревые на 10 сек. Убедитесь, что все решения на дне пробирки, а затем инкубируют при комнатной температуре в течение 10 мин.
- За 1 мкл ДНК плазмиды, добавить 10 мкл Effectene (см. таблицу).
- За 1 мкл pGFP, добавить 10 мкл Effectene (табл. II).
- За 1 мкл pBFP, добавить 10 мкл Effectene (табл. II).
- За 1 мкл pBFP и 1 мкл ON, добавить 20 мкл Effectene (табл. II).
- За 1 мкл pBFP и 5 мкл ON, добавить 60 мкл Effectene (табл. II).
- За 1 мкл pBFP и 10 мкл, добавьте 110 мкл Effectene (табл. II).
- Принесите каждую пробирку, чтобы окончательный объем 1000 мкл, добавив нагревается СМИ по каплям к ДНК / буфер / Enhancer / Effectene смеси. ДНК может вызвать в этом месте, если средства массовой информации добавляется слишком быстро. Аккуратно перемешать с помощью пипетки вверх и вниз 3-4 раза.
- За 1 мкл ДНК плазмиды, добавьте 882 мкл среды (см. таблицу).
- За 1 мкл pGFP, добавьте 882 мкл среды (табл. II).
- За 1 мкл pBFP, добавьте 882 мкл среды (табл. II).
- За 1 мкл pBFP и 1 мкл, добавьте 864 мкл среды (табл. II).
- За 1 мкл pBFP и 5 мкл, добавьте 792 мкл среды (табл. II).
- За 1 мкл pBFP и 10 мкл, добавьте 702 мкл среды (табл. II).
- Следующая постепенно добавить 1 мл соответствующего ДНК / Enhancer / Effectene смеси в каждую лунку по капле.
- Swirl пластину осторожно, чтобы обеспечить равномерное распределение клеток и трансфекция смеси. Incubatэлектронной клетки при нормальных условиях роста.
- На следующий день после трансфекции, мягко аспирата из средств массовой информации и постепенно заменить на эквивалентный объем свежей нагревается СМИ. Важно, чтобы не беспокоить слоев клеток в нижней части скважины, делая это.
- Через два дня после трансфекции изучения положительных клеток контроль трансфицированных pGFP под флуоресцентным микроскопом, чтобы определить эффективность трансфекции (рис. 2).
- SUA5B клетки растут очень быстро и будет зарастать. Через четыре дня после трансфекции тонкие этих клеток аспирационных из старых СМИ и добавляя медленно эквивалентный объем свежей нагревается СМИ.
- После добавления новых средств массовой информации для скважин, отсоединение всех клеток со дна каждую лунку pipeting вверх и вниз, отказаться от половины объема (1 мл) ячейки смесь и добавьте 1 мл свежего нагревается СМИ, чтобы принести окончательный объем до 2 мл.
- Проверьте клетки ежедневно, чтобы убедиться, что они здоровы и не заросшие, тонкие по мере необходимости.
- Разрешить клеткам расти в нормальных условиях течение пяти-семи дней после трансфекции, прежде чем собирать их для анализа.
- В 6:55 дней после трансфекции, собирать клеток аспирационных от старых СМИ во всех колодцах и добавлением 1 мл стерильного комнатной температуре PBS в каждую лунку.
- Отсоедините клетки от дна и с помощью пипетки вверх и вниз и передачи ячейки смеси 5 мл труб оснастки крышкой и сразу же проанализировать клеток с помощью проточной цитометрии.
Представитель Результаты
Рисунок 1. Untransfected здорового А. stephensi MSQ43 () и А. gambiae SUA5B (Б) клеток приблизительно в 80% слияния.
Рисунок 2. A. stephensi MSQ43 () и А. gambiae SUA5B (Б) клеток, трансфицированных положительные GFP контроль выражения плазмиды.
Рисунок 3. Проточная цитометрия данные, подтверждающие преобразование BFP для GFP с помощью мутагенеза одиночных нуклеотидных после трансфекции с BFP конкретных заблокирован нуклеиновых кислот-модифицированных олигонуклеотидов (LNA дополнений). SUA5B клетки трансфицированных GFP выражения плазмиды (pGFP) в качестве положительного контроля, с BFP выражения плазмиды (pBFP) в качестве отрицательного контроля, либо с pBFP и увеличение концентрации BFP конкретных LNA дополнений. (A) Память стратегии проточной цитометрии данные, показывающие, слева направо: вперед по сравнению стороне разброс живых клеток, пропидий йодида (PI) негативные клетки, и GFP-положительных клеток пяти дней после трансфекции. (B) График процент GFP-положительных клеток показано в () после трансфекции pBFP и увеличение концентрации LNA дополнений.
Таблица условий И. трансфекции.
Таблица II. Трансфекция условия, используемые на рисунке 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь мы представляем в пробирке и метод доказательства для целевого преобразования одного нуклеотида в эписомной гена-мишени после трансфекции МШУ дополнений в A. stephensi и А. gambiae клетках. МШУ-НА-опосредованной генной конверсии требует индукции сайт-специфического ответа репарации ДНК, наши данные показывают, что комар клетки могут поддерживать этот механизм для сайт-специфического мутагенеза. В то время как метод, представленный здесь, основан на преобразовании эписомной цели, наши данные показывают, что МШУ-НА-опосредованной преобразование может быть оптимизирован для хромосомных цели в комара клетки, как это было в других системах. Генной конверсии, следовательно, будет способствовать поколение стабильно трансформированные линии клеток без комаров сложных протоколов и длительных режимов выбора препарата. Кроме того, существующие технологии основаны на использовании мРНК конкретной флуоресцентные метки в живые клетки могут быть использованы для сортировки и обогащения комаров клеток с хромосомными преобразованы цели ген биологических исследованиях 5-7.
Успех этого метода в значительной степени зависит от использования здоровые клетки при плотности 70-80%. Кроме того, на всех этапах во время трансфекции процесса важно, чтобы определить, что ни плазмиды, ни LNA дополнений имеют осаждается из раствора, проверяя решение визуально для осадка. Одним из возможных модификации этого протокола является пластина клетки за 24 часа до начала трансфекции процесса. Это предлагается для медленно растущих или чувствительных клеточных линий. Мы обнаружили, что оптимальное соотношение плазмиды ДНК, чтобы LNA дополнений было 1:05, но это будет важно определить идеальное соотношение для каждой новой генной и клеточной линии интересов.
Различных исследований были выявлены комаров локусов и генов, которые придают устойчивость к малярии 8-10 паразита инфекции. Если эти цели поддаются манипуляции - через повышение или перенаправление выражения времени - они могут служить основой для генной инженерии в качестве стратегии для управления передачей малярийного паразита в природных популяциях вектор. Методология обсуждается здесь является новым и эффективным методом для введения мутаций в генах малярии сопротивления в лаборатории. Через эти манипуляции генами интереса, мы можем определить, в частности, как генных продуктов изменить сотовой антипаразитарный реакции в пробирке, важный шаг к пониманию борьбы с малярией развития паразита в естественных условиях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Мы хотели бы поблагодарить Эбби Spinner в Калифорнийском Национального центра изучения приматов за помощь с проточной цитометрии. Это исследование было поддержано финансирование из Национального института аллергии и инфекционных заболеваний (NIAID) Национального института здоровья (NIH) AI073745, AI080799 и AI078183.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Effectene transfection reagent | Qiagen | 301425 | |
| GFP control plasmid (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-neg) | Invitrogen | K4935-00 | |
| BFP plasmid (pcDNA5/FRT/TO) | Gift from Dr. Concordet3 | ||
| LNA-ONs | Gift from Dr. Concordet3 | ||
| MEM, Earle’s w/ glutamine | Invitrogen | 11095 | |
| Fetal calf serum (FCS) | Invitrogen | 16000 | |
| Schneider’s Drosophila medium | Invitrogen | 11730 | |
| Non-essential amino acids | Invitrogen | 11140 | |
| 10% D-glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | |
| Penicillin-streptomycin antibiotic | Invitrogen | 15140 | |
| 6-well culture plates | Corning | 3516 |
References
- Corby-Harris, V. D. A., Watkins de Jong, L., Pakpour, N., Antonova, Y., Ziegler, R., Ramberg, F., Lewis, E. E., Brown, J. M., Luckhart, S. L., Riehle, M. A. A novel strategy for controlling malaria transmission in the mosquito Anopheles stephensi. PLOS Pathogens. , Forthcoming (2010).
- Braasch, D. A., Corey, D. R. Locked nucleic acid (LNA): fine-tuning the recognition of DNA and RNA. Chem Biol. 8, 1-7 (2001).
- Andrieu-Soler, C. Stable transmission of targeted gene modification using single-stranded oligonucleotides with flanking LNAs. Nucleic Acids Res. 33, 3733-3742 (2005).
- Parekh-Olmedo, H., Drury, M., Kmiec, E. B. Targeted nucleotide exchange in Saccharomyces cerevisiae directed by short oligonucleotides containing locked nucleic acids. Chem Biol. 9, 1073-1084 (2002).
- Rhee, W. J., Santangelo, P. J., Jo, H., Bao, G. Target accessibility and signal specificity in live-cell detection of BMP-4 mRNA using molecular beacons. Nucleic Acids Res. 36, e30-e30 (2008).
- Marras, S. A., Kramer, F. R., Tyagi, S. Genotyping SNPs with molecular beacons. Methods Mol Biol. 212, 111-128 (2003).
- Tyagi, S., Bratu, D. P., Kramer, F. R. Multicolor molecular beacons for allele discrimination. Nat Biotechnol. 16, 49-53 (1998).
- Blandin, S. A. Dissecting the genetic basis of resistance to malaria parasites in Anopheles gambiae. Science. 326, 147-150 (2009).
- Niare, O. Genetic loci affecting resistance to human malaria parasites in a West African mosquito vector population. Science. 298, 213-216 (2002).
- Riehle, M. M. Natural malaria infection in Anopheles gambiae is regulated by a single genomic control region. Science. 312, 577-579 (2006).
