Summary
Oligonucleotiden kunnen worden gebruikt om de website speciaal een single nucleotide van getransfecteerde doelwitgenen vervanger in beide
Abstract
Plasmodium parasieten, de verwekker van malaria, worden overgedragen door de beten van geïnfecteerde Anopheles muggen wat resulteert in meer dan 250 miljoen nieuwe infecties per jaar. Ondanks tientallen jaren van onderzoek, is er nog steeds geen vaccin tegen malaria, met de nadruk op de noodzaak van nieuwe bestrijdingsstrategieën. Een innovatieve aanpak is het gebruik van genetisch gemodificeerde muggen zij daadwerkelijk toezicht kunnen malaria parasiet transmissie. Opzettelijke veranderingen van de cel signaalwegen in de mug, via gerichte mutagenese, is gebleken dat parasiet ontwikkeling 1 te reguleren. Uit deze studies, kunnen we beginnen om potentiële gen doelstellingen voor de transformatie te identificeren. Gerichte mutagenese is traditioneel gebaseerd op de homologe recombinatie tussen een target-gen en een groot DNA-molecuul. Echter, de bouw en het gebruik van dergelijke complexe DNA-moleculen voor het genereren van stabiel getransformeerde cellijnen is kostbaar, tijdrovend en vaak inefficiënt. Daarom is een strategie met behulp van gesloten nucleïnezuur-gemodificeerde oligonucleotiden (LNA-ons) biedt een bruikbaar alternatief voor de invoering van kunstmatige single nucleotide substituties in episomale en chromosomaal DNA-gen doelstellingen (beoordeeld in 2). LNA-ON-gemedieerde gerichte mutagenese is gebruikt om puntmutaties introduceren in interessante genen in gekweekte cellen van zowel de gist en muizen 3,4. We tonen hier dat LNA-ons kunnen worden gebruikt om een enkele nucleotide verandering in een getransfecteerde episomale doel dat resulteert in een switch van blauw fluorescerend eiwit (BFP) uitdrukking aan green fluorescent protein (GFP) tot uitdrukking in zowel de Anopheles gambiae en Anopheles stephensi cellen te introduceren . Deze conversie toont voor het eerst dat een effectieve mutagenese van target genen in mug cellen kan worden gemedieerd door LNA-ons en suggereert dat deze techniek van toepassing kunnen zijn op mutagenese van chromosomale doelen in vitro en in vivo.
Protocol
- Vóór het begin van het protocol, is het van belang om vast te stellen dat de mug cellen die worden gebruikt in het experiment gezond zijn en op ~ 80% confluentie als aanhanger (figuur 1). Begroeid of ongezonde cellen zal resulteren in een lage transfectie-efficiëntie en geven inconsistente resultaten.
- Warm-up van alle media voorafgaand aan in een 28 ° C waterbad te gebruiken gedurende 30 minuten.
- A. stephensi MSQ43 cellen nodig E5 medium: MEM, Earle's w / glutamine, 5% door warmte geïnactiveerd FCS, 0,2% D-glucose, 1% penicilline-streptomycine antibiotica, en 1% niet-essentiële aminozuren.
- A. gambiae SUA5B cellen nodig S2 medium: Schneider Drosophila medium, 5% door warmte geïnactiveerd FCS en 1% penicilline-streptomycine antibiotica
- Ontdooien en op te slaan alle transfectiereagens materialen, plasmiden, en oligonucleotiden op ijs.
- Alle procedures moeten worden uitgevoerd in een weefselkweek kap met steriele techniek.
- Voor hechtende cellen (A. gambiae SUA5B, A. stephensi MSQ43) aspireren uit oude media, zonder verstoring van de cellen, voeg een equivalent volume van verse media die is opgewarmd tot 28 ° C, en daarna afspoelen van de cellen van de onderkant van de fles met een pipet.
- De concentratie van de cellen moet worden bepaald en aangepast tot een uiteindelijke concentratie van 1x10 6 cellen / ml. Cellen kunnen worden bewaard bij kamertemperatuur tijdens de voorbereiding transfectiereagens materialen.
- Voeg 1 mL van de mug cellen (1x10 6 cellen / ml) aan elk putje van een 6-wells plaat. Stel een plaat voor elk experimentele conditie (zie hieronder).
Tabel I wordt een pipetteren regeling voor een algemeen transfectie. Tabel II schetst vijf voorwaarden om te testen voor een succesvolle mutagenese van een enkele nucleotide met behulp van BFP-specifieke LNA-ons. De eerste twee, pGFP en pBFP, zijn positieve en negatieve controles, respectievelijk. De overige zijn experimentele omstandigheden van pBFPs met toenemende concentraties van BFP-specifieke LNA-ons. In stappen 8 tot en met 12, dus toe te voegen voldoende hoeveelheden van de reagentia voor elke conditie. - Overdracht plasmide DNA om een steriele 1,5 ml microcentrifugebuis en voeg geschikt volume van het EG-buffer.
- Voor een pi plasmide DNA (1 pg / pl), voeg 99 ul van het EG-buffer.
- Voor een pi pGFP (1μg / pi), voeg 99 ul van het EG-buffer.
- Voor een pi pBFP (1μg / pi), voeg 99 ul van het EG-buffer.
- Voor een pi pBFP (1μg / il) en 1 pi ON (ug / ul), voeg 98 ul van het EG-buffer.
- Voor een pi pBFP (1μg / pi) en 5 pi ON (1μg / pi), voeg 94 ul van het EG-buffer.
- Voor een pi pBFP (1μg / il) en 10 pi ON (1μg / pi), voeg 89 ul van het EG-buffer.
- Dan voeg langzaam Enhancer per 1 ug van de gebruikte DNA.
- Voor 1 ui plasmide DNA, voeg 8 pi Enhancer.
- Voor 1 ui pGFP, voeg dan 8 pi Enhancer.
- Voor 1 ui pBFP, voeg dan 8 pi Enhancer.
- Voor een pi pBFP en 1 uL ON, voeg 16 ul Enhancer.
- Voor 1 ui pBFP en 5 microliter ON, voeg 48 ul Enhancer.
- Voor 1 pL pBFP en 10 uL ON, voeg 88 ul Enhancer.
- Vortex DNA / buffer / Enhancer mengsel voor 1 seconde en zorg ervoor dat alle van de oplossing is op de bodem van de buis. Dan incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten.
- Voeg Effectene reagens per 1 ug plasmide DNA en vortex voor 10 sec. Bevestigen dat alle van de oplossing is op de bodem van de buis en dan incuberen bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten.
- Voor 1 ui plasmide DNA, voeg 10 ul Effectene (tabel I).
- Voor 1 ui pGFP, voeg 10 ul Effectene (Tabel II).
- Voor 1 ui pBFP, voeg 10 ul Effectene (Tabel II).
- Voor een pi pBFP en 1 uL ON, voeg 20 ul Effectene (Tabel II).
- Voor 1 ui pBFP en 5 microliter ON, voeg 60 ul Effectene (Tabel II).
- Voor 1 pL pBFP en 10 uL ON, voeg 110 ul Effectene (Tabel II).
- Breng elke buis tot een eindvolume van 1000 il door het toevoegen van warm media druppelsgewijs aan de DNA / buffer / Enhancer / Effectene mengsel. DNA kan neerslaan op dit moment als de media te snel toegevoegd. Voorzichtig mengen door en neer te pipetteren 3-4 keer.
- Voor 1 ui plasmide DNA, voeg 882 ul media (tabel I).
- Voor 1 ui pGFP, voeg 882 ul media (tabel II).
- Voor 1 ui pBFP, voeg 882 ul media (tabel II).
- Voor een pi pBFP en 1 uL ON, voeg 864 ul media (tabel II).
- Voor 1 ui pBFP en 5 microliter ON, voeg 792 ul media (tabel II).
- Voor 1 pL pBFP en 10 uL ON, voeg 702 ul media (tabel II).
- Volgende voeg langzaam 1 ml van de juiste DNA / Enhancer / Effectene mengsel aan elk putje een druppel per keer.
- Swirl de plaat voorzichtig om een uniforme verdeling van de cellen en transfectie mix te garanderen. Incubate-cellen in normale groeiomstandigheden.
- Een dag na transfectie, Zuig voorzichtig uit de media en langzaam te vervangen door een gelijkwaardige hoeveelheid vers warm media. Het is belangrijk om niet de cel lagen verstoren op de bodem van de putten bij het doen van dit.
- Twee dagen na transfectie onderzoeken positieve controle cellen getransfecteerd met pGFP bij tl-microscoop om transfectie-efficiëntie (figuur 2) te bepalen.
- SUA5B cellen groeien zeer snel en zullen overwoekerd. Vier dagen na transfectie dun deze cellen door opzuigen uit de oude media en het toevoegen van langzaam een gelijkwaardige hoeveelheid vers warm media.
- Na het toevoegen van nieuwe media aan de putjes, los alle cellen van de onderkant van elk goed door pipetteren op en neer, gooi de helft van het volume (1 ml) van de cel mengsel en voeg 1 ml vers warm media om het uiteindelijke volume te brengen tot 2 mL.
- Dagelijkse controle cellen die ervoor zorgen dat ze gezond zijn en niet overwoekerd, dun als dat nodig is.
- Laat de cellen onder normale omstandigheden groeien vijf tot zeven dagen na transfectie alvorens ze te verzamelen voor analyse.
- Om vijf tot zeven dagen na transfectie, het verzamelen van de cellen door aspireren van de oude media in alle putten en het toevoegen van 1 ml steriel kamertemperatuur PBS aan elk putje.
- Los cellen van de onderkant van de goed door en neer te pipetteren en overdracht celmengsel tot 5 ml snap cap buizen en direct te analyseren cellen via flowcytometrie.
Representatieve resultaten
Figuur 1. Ongetransfecteerde gezonde A. stephensi MSQ43 (A) en A. gambiae SUA5B (B) cellen op ongeveer 80% confluentie.
Figuur 2. A. stephensi MSQ43 (A) en A. gambiae SUA5B (B) cellen getransfecteerd met positieve controle GFP plasmide uiten.
Figuur 3. Flowcytometrie gegevens bevestigen conversie van BFP om GFP via mutagenese van een enkele nucleotide na transfectie met BFP-specifieke opgesloten nucleïnezuur-gemodificeerde oligonucleotiden (LNA-ons). SUA5B cellen werden getransfecteerd met een GFP expressie plasmide (pGFP) als positieve controle, met een BFP uiten van plasmide (pBFP) als een negatieve controle, of met pBFP en toenemende concentraties van BFP-specifieke LNA-ons. (A) Poortsignalen strategie voor flowcytometrie gegevens waaruit blijkt van links naar rechts: vooruit versus zijwaartse verstrooiing van levende cellen, propidiumjodide (PI) negatieve cellen, en GFP positieve cellen vijf dagen na transfectie. (B) Grafiek van het percentage van de GFP positieve cellen getoond in (A) na transfectie met pBFP en de toenemende concentraties van LNA-ons.
Tabel I. Transfectie omstandigheden.
Tabel II. Transfectie voorwaarden worden gebruikt in figuur 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier presenteren wij een in-vitro-methode en aanwijzingen voor gerichte omzetting van een enkele nucleotide in een episomaal gen doelwit na transfectie van LNA-ONS in A. stephensi en A. gambiae cellen. LNA-ON-gemedieerde genconversie vereist inductie van een site-specifieke DNA-herstel reactie; onze gegevens blijkt dat de mug cellen kunnen dit mechanisme voor site-specifieke mutagenese ondersteuning. Terwijl de hier gepresenteerde methode is gebaseerd op de omzetting van een episomaal doel, onze gegevens suggereren dat LNA-ON-gemedieerde conversie kan worden geoptimaliseerd voor chromosomale doelen in mug cellen zoals het is in andere systemen. Genconversie, daarom zou de generatie van stabiel getransformeerde mug cellijnen zonder ingewikkelde protocollen en langdurig medicijnen selectie regimes. Verder, bestaande technologie gebaseerd op het gebruik van mRNA-specifieke tl-tags in levende cellen kunnen worden ingezet voor het sorteren en muggen cellen te verrijken met geconverteerde chromosomaal gen doelstellingen voor biologische studies 5-7.
Het succes van deze methode hangt sterk van het gebruik van gezonde cellen bij een dichtheid van 70-80%. Daarnaast, bij alle stappen tijdens de transfectie proces is het belangrijk om vast te stellen dat noch het plasmide, noch LNA-ons zijn neergeslagen uit de oplossing door het controleren van de oplossing visueel voor neerslag. Een mogelijke wijziging van dit protocol is om het bord van de cellen 24 uur voorafgaand aan het begin van het transfectie proces. Dit wordt voorgesteld voor langzaam groeiende of gevoelige cellijnen. We vonden dat de optimale verhouding van plasmide DNA om LNA-Ons was 01:05, maar het zal belangrijk zijn om de ideale verhouding te bepalen voor elk nieuw gen en cellijn van belang.
Een verscheidenheid van studies hebben mug loci en genen die resistentie verlenen tegen malaria parasiet infectie 8-10. Indien deze doelstellingen vatbaar zijn voor manipulatie - via de versterking van of omleiding van meningsuiting timing - ze kunnen een basis vormen voor genetische manipulatie als een strategie om malariaparasiet Transmission Control in natuurlijke populaties vector te bieden. De methodiek hier besproken is een nieuwe en effectieve techniek voor het introduceren van mutaties in de malaria resistentiegenen in het laboratorium. Door deze manipulaties van genen van belang zijn, kunnen we specifiek bepalen hoe genproducten cellulaire anti-parasiet reacties veranderen in vitro, een cruciale stap voor het begrijpen van de controle van malaria parasiet ontwikkeling in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
We willen graag Abbie Spinner danken aan het California National Primate Research Center voor haar hulp bij flowcytometrie. Dit onderzoek werd ondersteund door de financiering van het Nationaal Instituut voor Allergie en Infectieziekten (NIAID) National Institutes of Health (NIH) AI073745, AI080799, en AI078183.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Effectene transfection reagent | Qiagen | 301425 | |
| GFP control plasmid (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-neg) | Invitrogen | K4935-00 | |
| BFP plasmid (pcDNA5/FRT/TO) | Gift from Dr. Concordet3 | ||
| LNA-ONs | Gift from Dr. Concordet3 | ||
| MEM, Earle’s w/ glutamine | Invitrogen | 11095 | |
| Fetal calf serum (FCS) | Invitrogen | 16000 | |
| Schneider’s Drosophila medium | Invitrogen | 11730 | |
| Non-essential amino acids | Invitrogen | 11140 | |
| 10% D-glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | |
| Penicillin-streptomycin antibiotic | Invitrogen | 15140 | |
| 6-well culture plates | Corning | 3516 |
References
- Corby-Harris, V. D. A., Watkins de Jong, L., Pakpour, N., Antonova, Y., Ziegler, R., Ramberg, F., Lewis, E. E., Brown, J. M., Luckhart, S. L., Riehle, M. A. A novel strategy for controlling malaria transmission in the mosquito Anopheles stephensi. PLOS Pathogens. , Forthcoming (2010).
- Braasch, D. A., Corey, D. R. Locked nucleic acid (LNA): fine-tuning the recognition of DNA and RNA. Chem Biol. 8, 1-7 (2001).
- Andrieu-Soler, C. Stable transmission of targeted gene modification using single-stranded oligonucleotides with flanking LNAs. Nucleic Acids Res. 33, 3733-3742 (2005).
- Parekh-Olmedo, H., Drury, M., Kmiec, E. B. Targeted nucleotide exchange in Saccharomyces cerevisiae directed by short oligonucleotides containing locked nucleic acids. Chem Biol. 9, 1073-1084 (2002).
- Rhee, W. J., Santangelo, P. J., Jo, H., Bao, G. Target accessibility and signal specificity in live-cell detection of BMP-4 mRNA using molecular beacons. Nucleic Acids Res. 36, e30-e30 (2008).
- Marras, S. A., Kramer, F. R., Tyagi, S. Genotyping SNPs with molecular beacons. Methods Mol Biol. 212, 111-128 (2003).
- Tyagi, S., Bratu, D. P., Kramer, F. R. Multicolor molecular beacons for allele discrimination. Nat Biotechnol. 16, 49-53 (1998).
- Blandin, S. A. Dissecting the genetic basis of resistance to malaria parasites in Anopheles gambiae. Science. 326, 147-150 (2009).
- Niare, O. Genetic loci affecting resistance to human malaria parasites in a West African mosquito vector population. Science. 298, 213-216 (2002).
- Riehle, M. M. Natural malaria infection in Anopheles gambiae is regulated by a single genomic control region. Science. 312, 577-579 (2006).
