Summary
Oligonukleotide können die Besucher genutzt werden speziell Ersatz eines einzelnen Nukleotids von transfizierten Zielgene in beiden
Abstract
Plasmodium Parasiten, der Erreger der Malaria, durch den Stich infizierter Anopheles-Mücken sich in mehr als 250 Millionen Neuinfektionen pro Jahr übertragen. Trotz jahrzehntelanger Forschung gibt es noch keinen Impfstoff gegen Malaria, die die Notwendigkeit für neue Bekämpfungsstrategien. Ein innovativer Ansatz ist die Verwendung von gentechnisch veränderten Mücken wirksam zu kontrollieren Malaria-Parasiten-Übertragung. Absichtliche Veränderungen der Zell-Signalwege in der Mücke, durch gezielte Mutagenese, haben sich Parasiten Entwicklung 1 zu regeln. Aus diesen Studien, können wir beginnen, um potenzielle Gen-Targets für die Transformation zu identifizieren. Durch gezielte Mutagenese wurde traditionell auf die homologe Rekombination zwischen einem Zielgen und ein großer DNA-Molekül verlassen. Allerdings ist der Aufbau und die Verwendung solcher komplexer DNA-Moleküle für die Erzeugung von stabil transformierten Zelllinien kostspielig, zeitaufwändig und oft ineffizient. Daher stellt eine Strategie mit gesperrten Nukleinsäure-modifizierte Oligonukleotide (LNA-ons) eine sinnvolle Alternative für die Einführung von künstlichen single nucleotide Substitutionen in episomalen und chromosomale DNA Gen-Targets (reviewed in 2). LNA-ON-vermittelte gezielte Mutagenese wurde verwendet, um Punktmutationen in Genen von Interesse in kultivierten Zellen von Hefe-und Mäuse 3,4 einzuführen. Wir zeigen hier, dass LNA-ONs verwendet werden, um ein einzelnes Nukleotid Änderung in einer transfizierten episomalen Ziel, das in einem Wechsel von blau fluoreszierenden Protein (BFP) zum Ausdruck grün fluoreszierende Protein (GFP)-Expression in beiden Anopheles gambiae und Anopheles stephensi Zellen führt einzuführen . Diese Umwandlung zeigt zum ersten Mal, dass eine wirksame Mutagenese von Zielgenen in Mücke-Zellen durch LNA-ons können vermittelt werden, und schlägt vor, dass diese Technik kann für Mutagenese von chromosomalen Ziele in vitro und in vivo.
Protocol
- Vor dem Start des Protokolls ist es wichtig, festzustellen, dass die Mücke Zellen im Experiment verwendeten gesund sind und bei ~ 80% Konfluenz, wenn Anhänger (Abbildung 1). Overgrown oder kranken Zellen wird in geringer Transfektionseffizienz führen und inkonsistente Ergebnisse liefern.
- Warm up alle Medien vor, in einem 28 ° C Wasserbad für 30 Minuten verwenden.
- A. stephensi MSQ43 Zellen benötigen E5 Medium: MEM, Earle w / Glutamin, 5% hitzeinaktiviertem FCS, 0,2% D-Glucose, 1% Penicillin-Streptomycin Antibiotikum, und 1% nicht-essentiellen Aminosäuren.
- A. gambiae SUA5B Zellen benötigen S2 Medium: Schneiders Drosophila Medium, 5% hitzeinaktiviertem FCS und 1% Penicillin-Streptomycin Antibiotikum
- Tauwetter und speichern Sie alle Transfektionsreagenz Materialien, Plasmide und Oligonukleotide auf dem Eis.
- Alle Verfahren sollten in einer Gewebekultur Kapuze mit sterilen Technik durchgeführt werden.
- Für adhärente Zellen (A. gambiae SUA5B, A. stephensi MSQ43) absaugen alten Medien, ohne die Zellen, fügen Sie eine äquivalente Menge an frischem Medium, das zu 28 wurde ° C erwärmt und dann abspülen Zellen vom Boden der Kolben mit einer Pipette.
- Die Konzentration der Zellen zu bestimmen und angepasst, um eine endgültige Konzentration von 1x10 6 Zellen / ml. Die Zellen können bei Raumtemperatur aufbewahrt werden während der Vorbereitung Transfektionsreagenz Materialien.
- 1 ml der Moskito-Zellen (1x10 6 Zellen / ml) in jede Vertiefung einer 6-Well-Platte. Richten Sie eine Platte für jede experimentelle Bedingung (siehe unten).
Tabelle I ist ein Pipettierschema für eine allgemeine Transfektion. Tabelle II stellt fünf Bedingungen für eine erfolgreiche Mutagenese eines einzelnen Nukleotids mit BFP-spezifische LNA-ONs testen. Die ersten beiden, pGFP und pBFP, sind positive und negative Kontrollen. Die restlichen sind experimentelle Bedingungen pBFPs mit steigenden Konzentrationen von BFP-spezifische LNA-ons. In den Schritten 8 bis 12, fügen Sie entsprechende Volumina der Reagenzien entsprechend für jede Bedingung. - Transfer-Plasmid-DNA in ein steriles 1,5 ml Reaktionsgefäß und fügen entsprechende Volumen von EC-Puffer.
- Für 1 ul Plasmid-DNA (1 pg / mL), fügen Sie 99 ul der EG-Puffer.
- Für 1 ul pGFP (1 g / mL), fügen Sie 99 ul der EG-Puffer.
- Für 1 ul pBFP (1 g / mL), fügen Sie 99 ul der EG-Puffer.
- Für 1 ul pBFP (1 g / mL) und 1 ul ON (pg / mL), fügen Sie 98 ul der EG-Puffer.
- Für 1 ul pBFP (1 g / mL) und 5 ul ON (1 g / mL), fügen Sie 94 ul der EG-Puffer.
- Für 1 ul pBFP (1 g / mL) und 10 ul ON (1 g / mL), fügen Sie 89 ul der EG-Puffer.
- Dann langsam zugeben Enhancer pro 1 pg DNA verwendet.
- Für 1 ul Plasmid-DNA, addieren Sie 8 ul Enhancer.
- Für 1 ul pGFP, addieren Sie 8 ul Enhancer.
- Für 1 ul pBFP, addieren Sie 8 ul Enhancer.
- Für 1 ul pBFP und 1 ul ON, werden 16 ul Enhancer.
- Für 1 ul pBFP und 5 ul ON, fügen Sie 48 ul Enhancer.
- Für 1 ul pBFP und 10 ul ON, fügen Sie 88 ul Enhancer.
- Vortex DNA / Puffer / Enhancer Mischung für 1 sec und stellen Sie sicher, die gesamte Lösung ist an der Unterseite des Rohres. Dann bei Raumtemperatur Inkubation für 5 min.
- Add Effectene Reagenz pro 1 pg Plasmid-DNA und Vortex für 10 Sekunden. Bestätigen Sie, dass die gesamte Lösung im unteren Bereich der Röhre und dann bei Raumtemperatur inkubieren für 10 min.
- Für 1 ul Plasmid-DNA, mit 10 ul Effectene (Tabelle I).
- Für 1 ul pGFP, mit 10 ul Effectene (Tabelle II).
- Für 1 ul pBFP, mit 10 ul Effectene (Tabelle II).
- Für 1 ul pBFP und 1 ul ON, mit 20 ul Effectene (Tabelle II).
- Für 1 ul pBFP und 5 ul ON, mit 60 ul Effectene (Tabelle II).
- Für 1 ul pBFP und 10 ul ON, fügen Sie 110 ul Effectene (Tabelle II).
- Bringen Sie jedes Röhrchen auf ein Endvolumen von 1000 ul, indem erwärmt Medien tropfenweise zu der DNA / Puffer / Enhancer / Effectene Mischung. DNA ausfallen kann an dieser Stelle, wenn die Medien zu schnell aufgenommen wird. Vorsichtig durch Auf-und Abpipettieren 3-4 mal zu mischen.
- Für 1 ul Plasmid-DNA, fügen Sie 882 ul Medium (Tabelle I).
- Für 1 ul pGFP, fügen Sie 882 ul Medium (Tabelle II).
- Für 1 ul pBFP, fügen Sie 882 ul Medium (Tabelle II).
- Für 1 ul pBFP und 1 ul ON, fügen Sie 864 ul Medium (Tabelle II).
- Für 1 ul pBFP und 5 ul ON, fügen Sie 792 ul Medium (Tabelle II).
- Für 1 ul pBFP und 10 ul ON, fügen Sie 702 ul Medium (Tabelle II).
- Next langsam 1 mL der entsprechenden DNA / Enhancer / Effectene Mischung in jede Vertiefung ein Tropfen auf einmal.
- Schwenken Sie die Platte vorsichtig, um eine gleichmäßige Verteilung der Zellen und die Transfektion Mischung. INCUBATe-Zellen unter normalen Wachstumsbedingungen.
- Einen Tag nach der Transfektion vorsichtig aspirieren aus Medien und langsam mit einem äquivalenten Volumen an frisch aufgewärmt Medien zu ersetzen. Es ist wichtig, nicht stören die Zellschichten an der Unterseite der Brunnen, wenn dies zu tun.
- Zwei Tage nach der Transfektion untersucht positive Kontroll-Zellen mit pGFP unter Fluoreszenzmikroskop zu Transfektionseffizienz (Abbildung 2) zu bestimmen, transfiziert.
- SUA5B Zellen wachsen sehr schnell und wird überwuchert. Vier Tage nach der Transfektion dünne dieser Zellen durch Absaugen aus den alten Medien und das Hinzufügen langsam ein äquivalentes Volumen an frisch aufgewärmt Medien.
- Nach dem Hinzufügen neuer Medien in die Vertiefungen, trennen Sie alle Zellen aus dem Boden jeder Vertiefung durch Pipettieren auf und ab, werfen Sie die Hälfte des Volumens (1 ml) der Zelle Mischung geben und 1 ml frisches erwärmt Medien auf das Endvolumen auf 2 zu bringen mL.
- Überprüfen Zellen täglich um sicherzustellen, dass sie gesund sind und nicht überwuchert, dünn wie nötig.
- Lassen Sie die Zellen, die unter normalen Bedingungen für die fünf Minuten vor sieben Tagen nach der Transfektion wachsen, bevor sie zu sammeln für die Analyse.
- In fünf Minuten vor sieben Tagen nach der Transfektion, sammeln die Zellen durch Absaugen der alten Medien in alle Brunnen und die Zugabe von 1 ml sterile Raumtemperatur PBS in jede Vertiefung.
- Lösen Zellen vom Boden der gut-und Abpipettieren und Transfer Zellgemisch zu 5 ml Schnappdeckel Rohre und sofort analysieren Zellen über Durchflusszytometrie.
Repräsentative Ergebnisse
Abbildung 1. Transfizierte gesunde A. stephensi MSQ43 (A) und A. gambiae SUA5B (B)-Zellen bei etwa 80% Konfluenz.
Abbildung 2. A. stephensi MSQ43 (A) und A. gambiae SUA5B (B) Zellen mit positiven Kontrolle GFP-exprimierenden Plasmid transfiziert.
Abbildung 3. Durchflusszytometrie Daten bestätigt Umwandlung von BFP mit GFP über Mutagenese eines einzelnen Nukleotids nach der Transfektion mit BFP-spezifische gesperrt Nukleinsäure-modifizierte Oligonukleotide (LNA-ons). SUA5B Zellen wurden mit einem GFP-exprimierenden Plasmid (pGFP) als positive Kontrolle transfiziert, mit BFP exprimierenden Plasmid (pBFP) als negative Kontrolle, oder mit pBFP und steigenden Konzentrationen von BFP-spezifische LNA-ons. (A) Gating-Strategie für die Durchflusszytometrie Daten, die zeigen von links nach rechts: vorwärts im Vergleich side scatter von lebenden Zellen, Propidiumiodid (PI)-negativen Zellen und GFP-positiven Zellen 5 Tage nach der Transfektion. (B) Graph des Prozentsatzes der GFP-positiven Zellen in (A) nach der Transfektion mit pBFP und steigenden Konzentrationen von LNA-ONs gezeigt.
Tabelle I. Die Transfektion Bedingungen.
Tabelle II. Transfektion Bedingungen in Abbildung 1 verwendet.
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Discussion
Hier präsentieren wir ein in vitro Verfahren und Beweise für die gezielte Umwandlung von einem einzigen Nukleotid in einem episomalen Gen Ziel nach der Transfektion von LNA-ons in A. stephensi und A. gambiae Zellen. LNA-ON-vermittelte Gen-Konvertierung erfordert Induktion einer ortsspezifischen DNA-Reparatur-Reaktion, unsere Daten zeigen, dass Moskito-Zellen können diesen Mechanismus für die ortsspezifische Mutagenese zu unterstützen. Während die hier vorgestellte Methode auf Umwandlung einer episomalen Ziel basiert, weisen unsere Daten darauf LNA-ON-vermittelte Umwandlung für chromosomale Ziele in Mücke-Zellen optimiert werden kann, wie es in anderen Systemen wurde. Gene Umwandlung würde also die Erzeugung von stabil transformierten Mücke Zelllinien ohne komplexe Protokolle und langwierige Medikament Auswahl Regimen zu erleichtern. Darüber hinaus bestehende Technologie auf der Verwendung von auf mRNA-spezifischen fluoreszierenden Markierungen in lebenden Zellen genutzt werden kann, zu sortieren und zu bereichern Moskito-Zellen mit chromosomalen Gen umgewandelt Ziele für biologische Studien 5-7 werden.
Der Erfolg dieser Methode hängt entscheidend von der Verwendung von gesunden Zellen in einer Dichte von 70-80%. Darüber hinaus bei allen Schritten während der Transfektion ist es wichtig, festzustellen, dass weder das Plasmid noch LNA-Ons aus der Lösung, indem Sie die Lösung visuell auf Niederschlag ausgefällt. Eine mögliche Änderung dieses Protokolls ist es, Platte die Zellen 24 Stunden vor Beginn der Transfektion zu. Dies ist für langsam wachsende oder sensitive Zelllinien vorgeschlagen. Wir fanden, dass das optimale Verhältnis von Plasmid-DNA, um LNA-ONs 01.05 war, aber es wird wichtig sein, das ideale Verhältnis für jedes neue Gen-und Zell-Linie von Interesse zu bestimmen.
Eine Vielzahl von Studien haben Moskito-Loci und Gene, die Resistenz gegen Malaria-Parasiten-Infektion 8-10 identifiziert. Wenn diese Ziele sind zugänglich für Manipulation - über die Verbesserung der oder die Umleitung des Ausdrucks Timing - sie können eine Grundlage für die Gentechnik als eine Strategie zur Malaria-Parasiten Übertragung in natürlichen Populationen Vektor-Steuerung bieten. Die Methodik diskutiert hier ist eine neuartige und effektive Methode zur Einführung von Mutationen in Malaria-Resistenzgene im Labor. Durch diese Manipulationen von Genen von Interesse, können wir gezielt bestimmen, wie Genprodukte zelluläre anti-Parasit-Reaktionen verändern in vitro, ein entscheidender Schritt zum Verständnis der Kontrolle der Malaria-Parasiten Entwicklung in vivo.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Wir möchten Abbie Spinner an der California National Primate Research Center für ihre Unterstützung bei der Durchflusszytometrie danken. Diese Studie wurde durch Mittel aus dem National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID) der National Institutes of Health (NIH) AI073745, AI080799 und AI078183 unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Effectene transfection reagent | Qiagen | 301425 | |
| GFP control plasmid (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-neg) | Invitrogen | K4935-00 | |
| BFP plasmid (pcDNA5/FRT/TO) | Gift from Dr. Concordet3 | ||
| LNA-ONs | Gift from Dr. Concordet3 | ||
| MEM, Earle’s w/ glutamine | Invitrogen | 11095 | |
| Fetal calf serum (FCS) | Invitrogen | 16000 | |
| Schneider’s Drosophila medium | Invitrogen | 11730 | |
| Non-essential amino acids | Invitrogen | 11140 | |
| 10% D-glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | |
| Penicillin-streptomycin antibiotic | Invitrogen | 15140 | |
| 6-well culture plates | Corning | 3516 |
References
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