Summary
in vitroおよび成虫の蛍光レポーターを表現するアルファウイルス形質導入システムを使用するための方法が説明されています。このテクニックは、の代わりに、またはレポーターに加えて、関心の任意のタンパク質を発現するように適合させることができる。
Abstract
アルファウイルス形質導入システム（ATS）は、感染時に関心のある遺伝子（GOI）を発現するための重要なツールです。 ATSSは蚊媒介性RNAウイルスのcDNAクローン（;トガウイルス科属のアルファウイルス ）から導出されます。 アルファウイルス属には約30の異なる蚊が媒介するウイルス種が含まれています。アルファウイルスは、エンベロープウイルスであり、一本鎖RNAゲノムを（〜11.7 KB）が含まれています。アルファウイルスは、ウイルスのゲノムと成熟のキャプシド形成に必要なウイルスの構造タンパク質をコードサブゲノムmRNAを転写。アルファウイルスは脊椎動物細胞では通常非常に溶解性であるが、持続的に最小限の細胞病理学に影響を受けやすい蚊の細胞に感染。これらの属性は、それらの蚊の遺伝子発現のための優れたツールとして利用できます。使用中の最も一般的なATSSは、シンドビスウイルス（SINV）から導出されます。 SINVの広範な種指向性は、昆虫鳥類、および哺乳類cells8の感染が可能になります。しかし、ATSSはよく9,10,20のような他のアルファウイルスに由来している。外来遺伝子の発現は、追加のウイルスのサブゲノムRNAの開始部位やプロモーターの挿入によって実現されています。外来遺伝子の配列はウイルス構造遺伝子の5'側に配置されているATSSは昆虫で安定したタンパク質発現のために使用されます。遺伝子配列が構造遺伝子の3'側に配置されているATSSは、RNAiと沈黙昆虫におけるその遺伝子の発現をトリガするために使用されます。
ATSSはベクトル-病原体相互作用、ウイルス複製の分子の詳細とメンテナンス感染サイクル3,4,11,19,21を理解するための貴重なツールであることが証明されている。特に、蛍光と生物発光レポーターの発現は、ベクターとウイルス伝送5,14-16,18でウイルス感染を追跡尽力している。さらに、ベクトル免疫応答は、GFP 2,9を表現するために設計さSINVの二系統を用いて記述されています。
ここで、我々はcDNAの感染性クローンから蛍光レポーター（GFP）を含むSINVの製造方法を示す。伝染性、完全長のRNAは、線形化されたcDNAクローンから転写される。感染性RNAをエレクトロポレーションによって許容標的細胞に導入する。トランスフェクションされた細胞は、GOIを発現している感染性ウイルス粒子を生成する。収穫されたウイルスは、ここで説明する蚊、、または他のホストの種を（ここでは図示せず）に感染するために使用されます。ベクトルの能力は、中腸外蛍光を検出することにより、または監視のウイルスの伝達7によって評価される。 GOIは、感染率の決定のために、細胞培養全体に広がるウイルスの便利な推定、露出蚊の普及、蚊からのウイルスの伝達を可能にするとベクトルの能力の急速なゲージを提供するので、蛍光レポーターを使用してください。
Protocol
次のプロトコルは、シンドビスウイルスMRE16に基づいてATSの生産と使用のために書かれています。 ATSは蚊ベクトルネッタイシマカでGFPを発現するように設計されています。アルファウイルスの数のcDNA感染クローン（シンドビスウイルス、チクングニヤウイルス、O'nyong -寧ウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス）は、ATSの（表1）として設計されている現在利用可能です。最良の結果を得るにはプラスミドDNAは、ウイルスcDNAの不要な再結合と損失を回避するために、そのようなSURE有能な細菌などのバクテリア（Stratagene社/アジレントテクノロジー）で増幅される。すべての感染性クローンのプラスミドは、流出の転写のために最後の即時の5'3の全長ゲノムRNAとユニークな制限エンドヌクレアーゼの転写のためのウイルスcDNAの終わり"で、バクテリオファージT7またはSP6プロモーターを持っている。それぞれのATSの場合、ユーザーは適切なバクテリオファージのDNA依存性RNAポリメラーゼとウイルスRNAゲノムのin vitro転写のためのユニークな制限エンドヌクレアーゼを使用する必要があります。
1。 cDNAクローンから感染性RNAの生成。
- 100μL反応におけるXhoI制限酵素20単位の（p5'dsMRE16 / GFP）プラスミド感染性クローンの5μgを線形化する。 37 2 - 3時間インキュベート° C
- 50μLのRNaseフリー水を用いてスピンカラムからDNAを溶出する、キアゲンQIAprep Spin Miniprepキット代替精製プロトコールを用いて線状化DNAを精製する。プラスミドの濃度は約1.0μg/μLのはずです。
- RNaseフリーの0.2 mLをPCRチューブに、プロトコルごとにアンビオンMAXIscriptキットを用いて50μLの転写反応は以下のようなセットアップ。
- 22.5μLRNaseフリーのdH 2 O
- 5.0μL線形DNAのテンプレート（1.0μg/μLの）
- 2.5μL10mMのATP
- 2.5μL10mMのCTP
- 2.5μL10mMのUTP
- 2.5μL1mMのGTP
- 2.5μL10mMのキャップアナログ（M 7 G（5'）pppは（5'）G）
- 5.0μL10X転写バッファー
- 5.0μLT7またはSP6ポリメラーゼミックス
- 50.0μL合計
- 22.5μLRNaseフリーのdH 2 O
- 37℃で1時間転写反応をインキュベート℃にインキュベーション後、反応はBHK - 21細胞のエレクトロポレーションのために直ちに使用する必要があります。エレクトロポレーションのためのBHK - 21細胞の調製は、インキュベーションの転写反応の間に開始する必要があります。
2。感染性RNAからウイルスの世代
- コンフルエント150センチメートル2（T - 150）ATSあたりフラスコBHK - 21細胞two 70〜80％をトリプシン処理。
- 15 mLのコニカル遠心チューブにすべてのセルを転送します。
- 2000rpmで遠心分離によってペレットは、細胞、10分、一般的な卓上遠心機で4℃。
- 滅菌PBSで再懸濁し、細胞マグネシウムなし+ +とCa + +。細胞をPBSで3回洗浄されるまで、手順2.3と2.4を繰り返します。
- 10％FBSを含むペレット化した細胞を0.5mLのMEMを再懸濁します。
- 10％FBSを90μLMEMで10μLの細胞を希釈し、血球計でカウント。もしMEM、10％FBSを含むと2.5〜12.5 × 10 7細胞/ mLのに必要な、希薄な細胞。
- 氷冷0.2センチメートルのエレクトロポレーションキュベットに、400μLの細胞懸濁液および20μLの転写反応を追加。キュベットから結露を拭いてください。
- 二回キュベットをパルス：450V、1200Ω、150μFを。我々は、電気セルのマニピュレータ、ハーバード装置モデルECM630を使用してください。
- 10％FBSを5mLのMEMを含む25cm 2の組織培養フラスコにキュベットの内容全体を配置。
- 5％CO 2で37℃でインキュベートフラスコ（秒）。
- 日常の感染症を監視する適切なフィルターセット（例えば、GFPフィルター付倒立蛍光顕微鏡を使用して：励起波長= 460〜490 nmの発光波長= 510〜550 nmの、またはDsRedフィルター：励起波長= 460〜560 nmの発光波長=> 590nmで）。
- 蛍光は、感染がコンフルエントと/またはCPEはフラスコ全体で表示されているであることを示唆する場合は、-80必要な、そしてストアとして、アリコートを、フラスコの内容を収集する30パーセントFBSを追加℃に必要に応じて、細胞溶解物を遠心分離（2000 rpm、10分、4℃）により、FBSを添加する前にクリアすることができます。
- 少なくとも一回の細胞の新しいフラスコを通過するには、ウイルス、後続の吸血アッセイのためのウイルスの力価を増加させる。
（3）蚊のOS感染あたり
- 血液（通常はデfibrinated羊の血を購入）し、ステップ2.13からの細胞培養由来のウイルス懸濁液を一緒に混ぜる。血液の食事の最後のウイルス力価は、一般的に蚊の効率的な腸の感染症のために〜1 × 10 7プラーク形成単位（PFU）/ mLのはずです。 、満腹にさせる5' -三リン酸（ATP）をアデノシンに蚊を刺激する0.02Mの最終濃度まで添加することができます。
- 蚊年5月人工フィーダから効率的に血液の供給にそれらを刺激するために感染する前に水と砂糖を奪われなければならない。剥奪の期間は、以前は死亡率を最小限にするために確立されるべきである。タイムズ紙は、蚊の種、出発点として、昆虫館等の湿度に依存する前のフィードへの砂糖の24時間と水の12Hを削除します。このプロトコルは、循環37℃の水で水ジャケット付きガラスfeeders17を使用しています。ブタ腸管膜は（つまり、徹底的にほとんどの食料品店で入手可能なケーシングソーセージを洗浄）フィーダーの口の上に配置されており、食事は、チャンバー内にピペットで入れる。様々なデザイン、膜およびプロトコルは、さまざまなベクトル型に対して利用可能です。
- 蚊が血で充血だけ蚊を選択するためにソートされます。充血した蚊は、上にオーガンジーで箱に転送され、蚊は28℃でインキュベートされる° C、75〜80パーセントの相対湿度GFPの発現のために処理されるまで。
4。蚊の胸腔内接種
胸腔内接種は節足動物に感染するための代替方法です。腸を介して普及が必要とされていないときに、このメソッドが使用されます。 （方法は以下に説明するが、技術はこの視覚実験で示されていません）。
- 蚊（5-10）の少数は、プラスチック製の保持チューブに保持するケージから吸引される。 15分は蚊を冷却する為、℃でのために密封された保持管を4に配置されます。
- 2 5蚊は、氷の上で休んでガラスのペトリ皿の上にチューブから流出される。使用していない場合や、蚊が移動し始める時にペトリ皿にふたをし。蚊の取り扱い時には、注意が操作されている蚊の数のトラックをカウントし、維持するために注意しなければなりません。蚊が寒さのテーブルの上にこぼしたされているように、合計数は、実験室のカウンターに記録されます。
- 針はNanoject特定のガラスと針のプラーを使用してキャピラリーチューブを融解することによって調製される。
- 69 NL接種の配信については、製造元の指示に従ってNanoject IIマイクロインジェクターを設定します。針が破損していないように針に接種を描画するときに注意が必要です。
- 解剖顕微鏡を使って、蚊の胸部に針を挿入して、接種のためのNanojectをアクティブにします。針が完全に蚊に浸透し、蚊のそれに続く死に至る、反対側を終了しないように蚊を接種するときは注意が必要。接種材料は、針から取り外す前に入ったことを確認するために、各蚊を確認してください。
- 蚊がまだ針にimpaledている間に接種した後、、他のすべての時間で、綿やコルク栓で接続されている側の小さな穴を通して紙持株カートンに入れてください。
- 蚊は、蚊の偶発的な放出を防止するために設けられている、テープコルクを慎重に、（最大約50カートンごとに）カートンに接種し、配置しているときに。 28 ° Cおよび80％相対湿度での昆虫館でさらにインキュベーションの前に安全な保持ビンでカートンを置きます。
5。蚊のモニタリング感染
- ° Cで約15分間蚊を固定するために4で紙保持カートンを置きます。
- 蛍光顕微鏡での使用に適合チルのテーブルに蚊の数が少ない（一度に5-10）転送する。
- 蛍光の有無に基づいて、蚊を調べて、並べ替える。さらに、蛍光強度は、感染のプロキシ定量的な測定として使用することができる。このようなmidguts、唾液腺などの蚊の組織、脂肪体は、蛍光のために切開し、監視することができます。
- 適切な場合、感染した蚊のインキュベーションを継続する紙のカートンに選択された蚊を返します。
6。伝送アッセイ（ウイルス伝播のデモを強制唾液分泌）
- 供給する前に24時間糖源の蚊を奪う。
- 脚と翼を削除する
- 一方の端で、加熱引っ張らとsnippedされて50μLキャピラリーチューブに、CargilleタイプBのイマージョンオイルまたは10％血清糖溶液の3〜5μLを加える。
- チューブに口吻を挿入します。オイルを使用している場合は、唾液の滴が口吻からしみ出さに見られます。 1％のpilocarbineのPBS中の溶液および0.1％ツイーン80の一つμLを刺激するために胸部に適用することができます。
- 60〜90分後、蚊を削除し、必要に応じてウイルス分離のための店。
- 100μLの20％FBS - PBSを含むチューブで遠心してチューブから溶液を除去。
- その後、滅菌フィルター0.2μmのシリンジフィルターを介して接種し、培養細胞に感染するフィルタリング接種を使用してください。
生物学的安全性の注意：このプロトコルは、説明します、生成、識別、および感染した蚊を監視するための方法。あなたの施設（チルのテーブル、すなわち、封じ込め施設、等）とIBCの承認に基づいて、あなたはたったの脱出を防ぐために、翼と脚を除去した後、それらを検査するために制限されることがあります。 SINVベースのATSのが生成され、BSL2環境で使用することができます。このようなチクングンヤ熱ウイルスや西部ウマ脳炎ウイルスのような他のアルファウイルスに基づいて、ATSのの使用は、BSL3施設が必要になります。
7。代表的な結果
ATS 5'dsMRE16 / GFPを用いてマーカー遺伝子（GFP）の発現の概要を図1に示されています。 BHK - 21およびC6/36（ ヒトスジシマカ ）の細胞でGFPの発現は、感染の0.01多重度で5'dsMRE16 / GFPウイルスによる細胞の感染後に特定のタイミングで、図2に示されています。図3は、ウイルスが感染血液の食事を介して配信されている蚊のアルファウイルスとATSウイルス感染の概要です。図4は、 ネッタイシマカの経口感染が続くATSのウイルスの〜10 7 PFU / mLの血液の食事の準備を示しています。感染した蚊と落射蛍光顕微鏡（図5）を使用して10日後に感染症で、選択された身体部分の全身のビュー。 GFPの検出および各蛍光マーカー遺伝子（図6）を発現するATS 5'dsMRE16ウイルス感染後、感染した蚊のmidgutsにDsRedタンパク質。 5'dsMRE16 / GFP ATSウイルス（図7）に感染した蚊を使って送信アッセイ。
表1。ATSは現在、蚊の遺伝子発現のために設計されている。
| アルファウイルス | ATS | 蚊 | リファレンス |
| シンドビスウイルス | TE / 3'2JとTE / 5'2J | ネッタイシマカ | 12 |
| Ochlerotatus triseriatus | 13 | ||
| 3'dsMRE16と 5'dsMRE16 | A.ネッタイシマカ | 5 | |
| コガタアカイエカ | 5 | ||
| 5'dsTR339 | A. AEG ypti | 2 | |
| チクングンヤ熱ウイルス | 3'dsCHIKVと 5'dsCHIKV | A.ネッタイシマカ/ A.ヒトスジシマカ | 20 |
| O'nyong寧ウイルス | 5'dsONNV | ハマダラカ | 1,9 |
| 西部ウマ脳炎ウイルス | 5'dsWEEV。マクミラン | アカイエカ瞼板 | Stauft ら 、未発表 |
表2。蚊の遺伝子発現のためにATSのを使用してのメリット/デメリット。
| 利点： |
| 高力価のウイルスの急速な生産 |
| 広い宿主範囲（SINV） |
| 高いRNA複製率 |
| 高い導入遺伝子の発現レベル |
| 操作する遺伝子の相対的な容易さ |
| 昆虫の安定した、持続的な遺伝子発現 |
| 昆虫の最小限の病理学 |
| 短所： |
| 脊椎動物細胞における短期的な表現のモード |
| 脊椎動物細胞に強い細胞変性効果 |
| 遺伝子の大きさの制限（<1KB、理想的に） |
| いくつかのアルファウイルスはBSL3の封じ込めが必要です |
図1：p5'dsMRE / GFP SINV表現GFPを用いたBHK - 21細胞におけるATSのウイルスの生産の概要。 in vitro転写に続いて、ゲノムATS RNAは、ウイルスが救助されたBHK - 21細胞に電気穿孔されています。 ATSのウイルスは、蚊に感染するために使用することができます。 SGPは=サブゲノムプロモーター。三ATS RNA種がセルに転写さLS、ゲノム、サブゲノム1とサブゲノム2 RNAを。 C（カプシド）、E2とE1糖蛋白質が感染性ウイルスを生成するためにATSゲノムが組み込まれます。
図2：SINV 5'dsMRE16 / GFPウイルス感染後蚊におけるGFPの発現（C6/36）細胞。
図3：ウイルス感染につながる蚊におけるATSのウイルス感染の概要。
図4：感染性の血液の食事に蚊を公開することによって、ATS SINV 5'dsMRE16感染。
図5：10日後に感染症でATS SINV 5'dsMRE16 / GFP感染。 GFPの全身の検出は、そのウイルスが中腸をエスケープして二次的組織に散在していることを示しています。図には、また播種性感染の指標となる選択された体の部分でGFPの発現を示しています。
図6：ATS SINV 5'dsMRE16 / GFPと5'dsMRE16 /特定の時間後感染でmidgutsのDsRedの感染。 Midgutsは通常、後の時代に、感染後に後部中腸全体に広がるウイルスを含む血液の食事を摂取後早期の感染症の明確な焦点を持っている。
図7：8日、感染後早ければATS 5'dsMRE16 /蚊唾液中のGFPの検出。アッセイは、ATSのウイルスの感染と5'dsMRE16 / GFPウイルスは安定的に蚊の外因性の潜伏期間を通じてGFPを発現できることを示して表示するように設計されています。左側のパネルには、キャピラリーチューブによだれ蚊を示し、中央のパネルは、1日と右側のパネル3日後の感染で唾液で感染C6/36細胞を示しています。
Discussion
メソッドは、研究者は蚊細胞培養と大人のメス蚊のアルファウイルスの感染に従うことを可能にするここで紹介。 ATSのウイルスを使用しての長所と短所を表2にまとめた。 ATS感染性クローンは、遺伝的にどんなGOIを表現するために操作することができますし、一本鎖抗体、RNAiの抑制、内因性遺伝子を標的とするアンチセンスRNA、およびアポトーシスタンパク質を発現するために使用されています。レポーターが使用されていない場合、このメソッドの撮像部は関係ありません。しかし、同じプロトコルの多くは、ATSのウイルスの救助、伝播、および蚊の感染に必要です。アルファウイルス形質導入システムに挿入する際の制限が導入遺伝子の最大サイズがあります。サイズの制約は、ATSを生成するために使用される親株によって異なりますが、そのようなホタルルシフェラーゼのような大規模なレポーター遺伝子は、蚊で使用するためにATSを構築するために使用されているものの、約1KB通常です。ウイルス学の背景の適度な量の研究室では、ATSのこれらのプロトコルに従って使用することができるはずです。研究室の数はすでにSINVベースのATSのを使用してのことです。
Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Acknowledgments
この作品は、国立衛生研究所（NIH R01 AI46435）とRMRCE（NIH AI065357）によってサポートされています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
| MAXIscript Kit | Ambion | AB1312 | Be sure to use a kit containing the appropriate polymerase for your construct. |
| Cap Analogue (m7G(5’)ppp(5’)G) | Ambion | AM8050 | |
| Nanoject II nanoliter injector | Drummond Scientific | 3-000-204 | |
| Electro Cell Manipulator | Harvard Apparatus | ECM 630 |
References
- Brault, A. C. Infection patterns of o'nyong nyong virus in the malaria-transmitting mosquito Anopheles gambiae. Insect Mol. Biol. 13, 625-625 (2004).
- Campbell, C. L. Aedes aegypti uses RNA interference in defense against Sindbis virus infection. BMC. Microbiol. 8, 47-47 (2008).
- Cirimotich, C. M. Suppression of RNA interference increases alphavirus replication and virus-associated mortality in Aedes aegypti mosquitoes. BMC. Microbiol. 9, 49-49 (2009).
- Capurro, deL. ara, M, Virus-expressed, recombinant single-chain antibody blocks sporozoite infection of salivary glands in Plasmodium gallinaceum-infected Aedes aegypti. Am. J. Trop. Med. Hyg. 62, 427-427 (2000).
- Foy, B. D. Development of a new Sindbis virus transducing system and its characterization in three Culicine mosquitoes and two lepidopteran species. Insect Mol. Biol. 13, 89-89 (2004).
- Foy, B. D., Olson, K. E. Alphavirus transducing systems. Adv. Exp. Med. Biol. 627, 19-19 (2008).
- Franz, A. W. Engineering RNA interference-based resistance to dengue virus type 2 in genetically modified Aedes aegypti. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103, 4198-4198 (2006).
- Hahn, C. S. Infectious Sindbis virus transient expression vectors for studying antigen processing and presentation. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89, 2679-2679 (1992).
- Keene, K. M. RNA interference acts as a natural antiviral response to O'nyong-nyong virus (Alphavirus; Togaviridae) infection of Anopheles gambiae. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101, 17240-17240 (2004).
- Lundstrom, K. Expression of mammalian membrane proteins in mammalian cells using Semliki Forest virus vectors. Methods Mol. Biol. 601, 149-149 (2010).
- Myles, K. M. Alphavirus-derived small RNAs modulate pathogenesis in disease vector mosquitoes. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 19938-19938 (1993).
- Olson, K. E. Genetically engineered resistance to dengue-2 virus transmission in mosquitoes. Science. 272, 884-884 (1996).
- Olson, K. E. The expression of chloramphenicol acetyltransferase in Aedes albopictus (C6/36) cells and Aedes triseriatus mosquitoes using a double subgenomic recombinant Sindbis virus. Insect Biochem. Mol. Biol. 24, 39-39 (1994).
- Olson, K. E. Development of a Sindbis virus expression system that efficiently expresses green fluorescent protein in midguts of Aedes aegypti following per os infection. Insect Mol. Biol. 9, 57-57 (2000).
- Parikh, G. R., Oliver, J. D., Bartholomay, L. C., C, L. A haemocyte tropism for an arbovirus. J. Gen. Virol. 90, 292-292 (2009).
- Pierro, D. J. Development of an orally infectious Sindbis virus transducing system that efficiently disseminates and expresses green fluorescent protein in Aedes aegypti. Insect Mol. Biol. 12, 107-107 (2003).
- Rutledge, L. C. W. ard, A, R., Gould, D. J. Studies on the feeding response of mosquitoes to nutritive solutions in a new membrane feeder. Mosq. News. 24, 407-407 (1964).
- Sanders, H. R. Sindbis virus induces transport processes and alters expression of innate immunity pathway genes in the midgut of the disease vector Aedes aegypti. Insect Biochem. Mol. Biol. 35, 1293-1293 (2005).
- Uhlirova, M. Use of Sindbis virus-mediated RNA interference to demonstrate a conserved role of Broad-Complex in insect metamorphosis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100, 15607-15607 (2003).
- Vanlandingham, D. L. Development and characterization of a double subgenomic chikungunya virus infectious clone to express heterologous genes in Aedes aegypti mosquitoes. Insect Biochem. Mol. Biol. 35, 1162-1162 (2005).
- Wang, H. Effects of inducing or inhibiting apoptosis on Sindbis virus replication in mosquito cells. J. Gen. Virol. 89, 2651-2651 (2008).
