Summary
체외에서 성인 모기에 형광 기자를 표현하는 alphavirus transducing 시스템을 사용 방법이 설명되어 있습니다. 이 기술은 대신 또는 기자 이외에 관심있는 단백질을 표현하는 적응 수 있습니다.
Abstract
Alphavirus transducing 시스템 (ATSs)는 감염 동안 유전자의 관심 (고이)를 표현하는 중요한 도구입니다. ATSs은 모기가 전파되는 RNA 바이러스의 cDNA 클론 (; 가족 Togaviridae 속의 Alphavirus)에서 파생됩니다. Alphavirus의 속은 약 30 다른 모기 매개 바이러스 종류가 포함되어 있습니다. Alphaviruses은 싸여 바이러스이며 단일 좌초 RNA의 genomes을 (~ 11.7 KB)이 포함되어 있습니다. Alphaviruses은 바이러스의 게놈과 성숙의 encapsidation에 필요한 바이러스의 구조 단백질을 인코딩 subgenomic mRNA를 고쳐 쓰다. Alphaviruses은 척추 세포에서 일반적으로 높은 lytic 있지만, 지속적으로 최소한의 cytopathology로 민감한 모기의 세포를 감염. 이러한 특성은 그들에게 모기 벡터의 유전자 표현을위한 훌륭한 도구를합니다. 사용중인 가장 일반적인 ATSs는 Sindbis 바이러스 (SINV)에서 파생됩니다. SINV의 광범위한 종류의 tropism는 곤충 조류, 그리고 포유류의 cells8의 감염 수 있습니다. 그러나, ATSs 잘 9,10,20 다른 alphaviruses에서 파생되었습니다. 외국 유전자 발현은 추가 바이러스성 subgenomic RNA의 개시 사이트 또는 발기인의 삽입에 의해 가능하게됩니다. 외인성 유전자 순서는 바이러스 유전자 구조 5 '위치에있는 ATSs는 곤충의 안정적인 단백질 발현을 위해 사용됩니다. 유전자 시퀀스 구조 유전자 3 '위치에있는 ATSs는, 곤충에 유전자의 RNAi과 침묵 표현을 트리거하는 데 사용됩니다.
ATSs는 벡터 병원체 상호 작용, 바이러스 복제의 분자 세부 사항 및 유지 보수 전염성 사이클 3,4,11,19,21을 이해하기위한 귀중한 도구가 될 입증합니다. 특히, 형광 및 발광 생물 기자의 표현은 벡터 및 바이러스 전송 5,14-16,18의 바이러스 감염을 추적 수단되었습니다. 또한, 벡터 면역 반응은 GFP 2,9을 표현하는 설계 SINV의 두 변종을 사용하여 설명하고 있습니다.
여기, 우리는 cDNA 클론 감염에서 형광 기자 (GFP)이있는 SINV의 생산을위한 방법을 제시한다. 전염성, 전체 길이 RNA는 선형 cDNA 클론으로부터 베꼈는데 있습니다. 감염성 RNA는 electroporation에 의해 허용 대상 세포에 도입입니다. Transfected 세포는 고이을 표현하는 전염성 바이러스 입자를 생성합니다. 수확 바이러스는 여기에 설명된 모기, 또는 다른 호스트 종 (이하 표시되지 않음) 감염하는 데 사용됩니다. 벡터 능력은 midgut 외부 형광을 감지하거나 모니터링 바이러스 전송 7 평가입니다. 고이가 세포 배양에 걸쳐, 모기에서 노출 모기, 바이러스 전송에 감염, 전파의 속도의 결정에 대한 바이러스 확산의 편리 추정 가능하며 벡터 능력의 급속한 게이지를 제공하는 등 형광등 기자 중 하나를 사용하십시오.
Protocol
다음 프로토콜은 Sindbis 바이러스 MRE16에 따라 ATS의 생산과 사용을위한 기록됩니다. ATS는 모기 Aedes aegypti 벡터에 GFP를 표현하기 위해 설계되었습니다. alphaviruses의 번호 (Sindbis 바이러스, Chikungunya 바이러스, O'nyong - nyong 바이러스, 서부 에콰인 뇌염 바이러스)의 cDNA 전염성 클론 ATS의 (표 1)로 설계되었는지 현재 사용할 수 있습니다. 최상의 결과를 얻으려면 플라스미드 DNA가 같은 불필요한 재조합 및 바이러스 cDNA의 손실을 방지해야 관할 세균 (Stratagene / 애질런트 테크놀)로 박테리아에서 증폭됩니다. 모든 전염성 클론 plasmids은 결선의 해독에 대한 최종 '전체 길이의 게놈 RNA의 전사와 3 독특한 제한 endonuclease에 대한 바이러스 cDNA의 끝에'이 바로 5 박테리오 파지 T7 또는 SP6 발기인 있습니다. 각 ATS 들어, 사용자는 적절한 박테리오 파지 DNA 의존 RNA 효소와 바이러스 RNA의 게놈의 체외의 해독에 대해 고유한 제한 endonuclease를 사용해야합니다.
1. cDNA 클론에서 감염성 RNA의 생성.
- 100 μL 반응에서 XhoI 제한 효소 20 단위 (p5'dsMRE16 / GFP) 플라스미드 전염성 클론의 5μg을 Linearize. 37 2 3H에 대해 품어 ° C
- 50 μL RNase가없는 물을 사용하여 스핀 칼럼에서 DNA를 eluting Qiagen QIAprep 스핀 Miniprep 키트 대체 정화 프로토콜을 사용하여 선형 DNA를 정화. 플라스미드 농도는 약 1.0 μg / μL해야합니다.
- RNase가없는 0.2 ML PCR 튜브에 설정 절차에 따라 앰비온 MAXIscript 키트를 사용하여 50 μL 전사 반응은 다음과 같습니다.
- 22.5 μL RNase 무료 DH 2 O
- 5.0 μL 선형 DNA 템플릿 (1.0 μg / μL)
- 2.5 μL 10mM ATP
- 2.5 μL 10mM CTP
- 2.5 μL 10mM UTP
- 2.5 μL 1mM GTP
- 2.5 μL 10mM 모자 아날로그 (M 7 G (5 ') PPP (5') G)
- 5.0 μL 10X 전송 버퍼
- 5.0 μL T7 또는 SP6 효소 믹스
- 50.0 μL 총
- 22.5 μL RNase 무료 DH 2 O
- 37 1 시간에 대한 전사 반응을 품어 ° C. 부화 후, 반응은 BHK - 21 세포의 electroporation을 위해 즉시 사용해야합니다. electroporation에 대한 BHK - 21 세포의 준비 배양 전사 반응 동안에 시작한다.
2. 감염성 RNA의 바이러스의 생성
- 합류 150cm 2 (T - 150) ATS 당 플라스크 BHK - 21 세포이 70-80%을 Trypsinize.
- 15 ML 원뿔 원심 분리기 튜브의 모든 세포를 전송합니다.
- 2,000 rpm으로 원심 분리하여 펠렛은 전지, 10 분, 기존의 탁상 원심 분리기에서 4 ° C.
- 없이 멸균 PBS에 Resuspend 세포 MG + + 및 CA + +. 세포는 PBS로 세 번 씻어 때까지 단계 2.3 및 2.4를 반복합니다.
- 10% FBS를 포함하는 pelleted 전지 0.5 ML의 멤를 Resuspend.
- 10% FBS와 90 μL 멤 10 μL 세포를 희석하고 hemacytometer 기대. 경우 멤 10 % FBS를 포함하는과 2.5-12.5 X 10 7 셀 / ML 필요, 희석 세포.
- 얼음 차가운 0.2 cm의 electroporation의 쿠베트하기 위해, 400 μL 세포 현탁액 20 μL 전사 반응을 추가합니다. 쿠베트에서 결로를 닦아주십시오.
- 450V, 1200Ω, 150 μF : 두 번 쿠베트을 펄스. 우리는 전기 세포 조작하는 사람, 하버드 장치 모델 ECM630을 사용합니다.
- 10% FBS 5 ML의 멤을 포함 25cm 두 조직 문화 플라스크에 쿠베트의 전체 내용을 넣으십시오.
- 5% CO 2와 37C에 품어 플라스크 (S).
- 여기 파장 = 460-490 nm의, 발광 파장 = 510-550 nm의, 또는 필터를 dsRed : 적절한 필터 설정 (예 : GFP 필터를 거꾸로 형광 현미경을 사용하여 일상적인 감염을 모니터링 여기 파장은 460-560 nm의 =, 발광 파장 => 590 NM).
- 형광은 감염이 합류 및 / 또는 CPE는 술병을 통해 볼 수 있습니다 제시하면, -80에서 필요하고, 매장으로 나누어지는를 술병의 내용을 수집 30% FBS를 추가 ° C. 원하는 경우, 세포 lysates은 (2000 RPM, 10 분, 4 ° C) FBS를 추가하기 전에. 원심 분리에 의해 삭제 될 수 있습니다
- 이후 혈액 먹이 assays에 대한 바이러스 titer를 증가 세포의 새 술병을 통해 적어도 한 번 통과 바이러스.
모기 3. 당 OS 감염
- 혈액 (보통 드 fibrinated 양의 혈액을 구입) 및 단계를 2.13에서 셀 - 문화 파생 바이러스 서스펜션을 함께 섞는다. 혈액 식사 최종 바이러스 titer는 일반적으로 ~ 1x10 7 플라크 형성 단위 (pfu) / 모기 midgut의 효율적인 감염에 대해 ML해야합니다. , 충혈시키다 5' - 삼인산 (ATP)를 아데노신에 모기를 자극하는 0.02M의 최종 농도에 추가할 수 있습니다.
- 모기 수 있습니다인공 피더에서 효율적으로 혈액 공급하도록 자극하는 감염 전에 물과 설탕을 박탈해야합니다. 빈곤 기간는 이전에 다음 ID로 사망률을 최소화하기 위해 설립해야합니다. 타임즈는, 모기 종, 기점으로 insectary 등 습도에 따라 이전에 피드에 설탕 24, 물 12h 제거됩니다. 이 프로토콜은 순환 37 ° C의 물로 물 외피 유리 feeders17를 사용합니다. 돼지의 창자 막 (즉, 철저하게 대부분의 식료품 가게에서 구할 수 케이싱 소시지 씻은)은 피더와 식사가 의회에 pipetted이다의 입을 통해 배치됩니다. 다양한 디자인, 세포막 및 프로토콜은 다른 벡터 유형에 사용할 수 있습니다.
- 모기는 피가 부풀어 오른만이 모기를 선택 정렬됩니다. 부풀어 오른 모기가 상단에 organdy와 판지 상자로 전송하고 모기가 28 incubated 아르 ° C, GFP 발현에 대한 처리까지 75-80% 상대 습도.
4. 모기 Intrathoracic 접종
Intrathoracic 접종은 arthropod들을 감염에 대한 대안 방법입니다. midgut을 통해 보급이 필요하지 않을 때이 방법을 사용합니다. (방법은 아래 설명하지만 기술이 영상 실험에서 표시되지 않습니다.)
- 모기 (5-10)의 소수가 플라스틱 개최 튜브로 잡고 케이지에서 aspirated입니다. 15 분 모기를 진정 ° C가 밀봉 보관 튜브는 4 배치됩니다.
- 2 5 모기는 얼음에서 휴식을 유리 페트리 접시에 관에서 흘렸어 것입니다. 사용하지 않거나 모기가 이동하기 시작하면 페트리 접시에 뚜껑을 놓으십시오. 모기의 취급 중에주의가 조작되는 모기의 수를 추적하는 계산 유지로 이동해야합니다. 모기가 진정 테이블에 쏟았 있기 때문에, 총수은 실험실 카운터에 기록됩니다.
- 바늘은 Nanoject 특정 유리와 바늘 풀러를 사용하여 모세관 튜브를 용해하여 준비가되어 있습니다.
- 69 NL inoculum의 제공을위한 제조 업체의 지침에 따라 Nanoject II microinjector를 설치합니다. 바늘이 손상되지 않도록 바늘에 inoculum를 그릴 때주의가 행사해야합니다.
- 해부 현미경을 사용하여 모기의 흉부에 바늘을 삽입하고 접종에 대한 Nanoject을 활성화해야합니다. 바늘 완전히 모기를 침투하고 모기의 후속 죽음에 결과 반대편을 종료하지 않도록 모기 inoculating 때주의가 행사해야합니다. inoculum가 바늘에서 제거하기 전에 입력 있는지 확인하기 위해 각 모기를 확인합니다.
- 모기가 여전히 바늘에 찔려 죽은 상태에서 접종 후, 다른 모든 시간에 커튼이나 코르크 스토퍼로 연결되는 측면에 작은 구멍을 통해 종이를 들고 카톤에 놓으십시오.
- 모기는 신중하게 카톤 (최대 약 50 카톤 당), 테이프 모기의 실수로 공개를 방지하기 위해 자리에 코르크로 주사하고 배치했으면. 28 ° C 80 % 상대 습도에서 insectary에서 추가 부화하기 전에 보안 지주 빈의 종이팩를 놓습니다.
5. 모기 감시 감염
- ° C 약 15 분 동안 모기를 무력화하기 위해 4 종이 들고 카톤를 놓습니다.
- 형광 현미경에 사용에 맞게 감기 테이블에 모기의 작은 숫자 (한 번에 50-10) 전송합니다.
- 형광의 유무에 따라 모기를 검사하고 정렬합니다. 또한, 형광 강도는 감염의 프록시 양적 측정으로 사용할 수 있습니다. 이러한 midguts, 침샘 등 모기 조직은 지방 시체는 형광에 대한 해부하고 모니터링할 수 있습니다.
- 적절한 경우, 감염된 모기의 부화를 계속 종이 판지 상자로 선정 모기를 반환합니다.
6. 전송 어세이 (바이러스 전송을 시연하기 위해 강제 타액의 분비)
- 피드 이전 24 H 설탕 소스의 모기를 박탈.
- 다리와 날개를 제거
- , 온수 뽑아 한 끝에 냈다되었습니다 50 μL 모세관하려면 Cargille B 타입의 집중 오일이나 10% 혈청 - 자당 솔루션의 3-5 μL를 추가합니다.
- 튜브에 코를 넣습니다. 기름을 사용하는 경우, 타액의 방울은 코에서 스며 나오다을 볼 수 있습니다. 1 % pilocarbine의 PBS에서 솔루션과 0.1 % 트윈 80 μL 하나는 자극에 대한 흉부에 적용할 수 있습니다.
- 60~90분 후, 모기를 제거하고 필요한 경우 바이러스 격리를 위해 저장합니다.
- 100 μL 20% FBS - PBS를 포함하는 튜브에 원심 분리하여 관에서 솔루션을 제거합니다.
- 다음 무균 필터 0.2 μm의 주사기 필터를 통해 inoculum 및 교양 세포를 감염하는 필터링된 inoculum을 사용합니다.
BIOSAFETY 참고 :이 프로토콜 설명, 생성 파악하고, 감염된 모기를 모니터링하는 방법. 귀하의 시설 (감기 테이블, 억제 시설 등 IE)와 IBC 승인에 따라, 당신은 탈출을 방지하기 위해 날개와 다리를 제거 후 그들을 조사하기 위해 제한될 수 있습니다. SINV 기반 ATS의 생성 및 BSL2 환경에서 사용할 수 있습니다. ATS의 사용은 이러한 Chikungunya 바이러 스나 서부 에콰인 뇌염 바이러스와 같은 다른 alphaviruses에 기초가 BSL3 시설을 필요합니다.
7. 대표 결과
ATS 5'dsMRE16 / GFP를 사용하여 마커 유전자 (GFP)의 표현의 개요는 그림 1에 표시됩니다. BHK - 21 C6/36 (Aedes albopictus) 세포에 GFP 표현은 감염의 0.01 다중성에서 5'dsMRE16 / GFP 바이러스와 세포의 감염 후 특정 시간에 그림 2에 표시됩니다. 그림 3은 바이러스가 infective 혈액 식사를 통해 제공되는 모기에 alphavirus 및 ATS 바이러스 감염의 개요입니다. 그림 4는 Aedes aegypti의 경구 감염 다음 ATS 바이러스 ~ 10 7 pfu / ML과 혈액 식사의 준비를 보여줍니다. epifluorescence 현미경 (그림 5)을 사용하여 감염된 모기와 10 일 게시물 감염에서 선택된 신체 부위의 전신보기. GFP의 감지 및 각 형광 마커 유전자 (그림 6)을 표현 ATS 5'dsMRE16 바이러스 감염에 따라 감염된 모기 midguts에 dsRED. 5'dsMRE16 / GFP ATS 바이러스 (그림 7)에 감염된 모기를 사용하여 전송 분석.
표 1. ATS는 현재 모기의 유전자 표현을위한 공학의.
| Alphavirus | ATS | 모기 | 참고 |
| Sindbis 바이러스 | TE / 3'2J 및 TE / 5'2J | Aedes aegypti | 12 |
| Ochlerotatus triseriatus | 13 | ||
| 3'dsMRE16과 5'dsMRE16 | A. aegypti | 5 | |
| Culex tritaeniorhynchus | 5 | ||
| 5'dsTR339 | A. AEG ypti | 2 | |
| Chikungunya 바이러스 | 3'dsCHIKV과 5'dsCHIKV | A. aegypti / A. albopictus | 20 |
| O'nyong nyong 바이러스 | 5'dsONNV | 아노 펠 레스 gambiae | 1,9 |
| 웨스턴 에콰인 뇌염 바이러스 | 5'dsWEEV. 맥밀런 | Culex tarsalis | Stauft 외., 발표되지 않은 |
표 2. 모기의 유전자 표현을위한 ATS의를 사용하는 장점 / 단점.
| 장점 : |
| 높은 titer 바이러스의 급속한 생산 |
| 광범위한 호스트 범위 (SINV) |
| 높은 RNA 복제 속도 |
| 하이 transgene 발현 수준 |
| 조작 유전자의 상대 용이성 |
| 곤충의 안정적이고 지속적인 유전자 발현 |
| 곤충의 최소 병리학 |
| 단점 : |
| 척추 세포의 단기 표현 모드 |
| 척추 세포에 강한 cytopathic 효과 |
| 유전자 크기 제한 (<1Kb, 이상) |
| 일부 alphaviruses는 BSL3 봉쇄를 필요로 |
그림 1 : p5'dsMRE / GFP GFP SINV 표현을 사용하여 BHK - 21 세포에서 ATS 바이러스 생산의 개요. 시험 관내 전사에 따라 게놈 RNA ATS는 바이러스가 구출됩니다 BHK - 21 세포에 electroporated입니다. ATS 바이러스 그러면 모기를 감염하는 데 사용할 수 있습니다. SGP는 = subgenomic 발기인. 세 ATS RNA 종은 셀에 베꼈는데 아르혹시, 게놈, subgenomic 1 subgenomic이 RNAS. C (capsid)는, E2와 E1 glycoproteins은 전염성 바이러스를 생성하는 ATS 게놈과 함께 조립하고 있습니다.
그림 2 : SINV 5'dsMRE16 / GFP 바이러스에 감염 모기에 다음과 같은 GFP (C6/36)의 표현이 세포.
그림 3 : 바이러스 전송로 이어지는 모기에 ATS 바이러스 감염의 개요.
그림 4 : ATS SINV infective 혈액 식사하는 모기를 노출하여 5'dsMRE16 감염.
그림 5 : 10 일 게시물 감염에서 ATS SINV 5'dsMRE16 / GFP 감염. GFP의 몸 전체 검색은 바이러스가 midgut 탈출 및 보조 조직에 전파했다 보여줍니다. 그림은 또한 전파 감염을 나타내는 것입니다 선택된 신체 부위에서 GFP 발현을 보여줍니다.
그림 6 : ATS SINV 5'dsMRE16 / GFP 및 5'dsMRE16 / 특정 시간 이후의 감염에 midguts의 dsRED 감염. Midguts은 일반적으로 나중에 시간 후 감염의 사후 midgut에 걸쳐 펼쳐지는 혈액 식사가 포함된 바이러스를 섭취 후 초기 감염의 뚜렷한 foci 있습니다.
그림 7 : 8 일 게시 감염 빠르면 ATS 5'dsMRE16 / 모기 타액에서 GFP의 탐지. 분석은 ATS 바이러스 및 5'dsMRE16 / GFP 바이러스가 안정적으로 모기에 외부 잠복기에 걸쳐 GFP를 표현할 수있는 것을 보여줍니다의 전송을 표시하도록 설계되었습니다. 왼쪽 패널은 모세관에 침 모기를 보여줍니다, 중앙 패널은 일일 오른쪽 패널 3 일간 게시 감염에서 타액 감염 C6/36 세포를 보여줍니다.
Discussion
방법은 연구자 모기 세포 배양 및 성인 여성 모기에 alphavirus의 감염을 따라 수 있도록 여기를 발표했다. ATS 바이러스를 사용하는 장점과 단점은 표 2에 요약됩니다. ATS 전염성 복제는 유전자에 고이을 표현하는 조작 수 있으며, 단일 사슬 항체, RNAi의 진압, 내생 유전자를 대상으로 안티 센스 RNAS, 그리고 프로 apoptotic 단백질을 표현하는 데 사용되었습니다. 기자가 사용하지 않을 경우,이 방법의 영상 부분은 관련이 없습니다. 그러나, 같은 프로토콜 많은 ATS 바이러스 구조, 전파하고, 모기가 감염 필요합니다. alphavirus의 transducing 시스템에 삽입하면 제한 transgene의 최대한의 크기가 있습니다. 크기 제약은 ATS를 생성하는 데 사용되는 부모의 변형에 따라 다르지만 같은 반딧불 루시페라제 같은 큰 기자 유전자가 모기에 사용하기 위해 ATS 건설에 사용되고 있지만 1킬로바이트에 대해 보통입니다. 바이러스학 배경의 겸손한 양의 연구소는 이러한 프로토콜을 다음과 ATS의를 사용할 수 있어야합니다. 연구 실험실의 숫자가 이미 SINV 기반 ATS의를 사용하여 서명한.
Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 작품은 국립 보건원 (NIH R01 AI46435)와 RMRCE (NIH AI065357)에 의해 지원됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
| MAXIscript Kit | Ambion | AB1312 | Be sure to use a kit containing the appropriate polymerase for your construct. |
| Cap Analogue (m7G(5’)ppp(5’)G) | Ambion | AM8050 | |
| Nanoject II nanoliter injector | Drummond Scientific | 3-000-204 | |
| Electro Cell Manipulator | Harvard Apparatus | ECM 630 |
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