Summary
Méthodes d'utilisation des systèmes de transduction alphavirus pour exprimer des reporters fluorescents in vitro et chez les moustiques adultes sont décrits. Cette technique peut être adaptée pour exprimer toute protéine d'intérêt en remplacement ou en complément à un journaliste.
Abstract
Alphavirus systèmes de transduction (SNP) sont des outils importants pour exprimer des gènes d'intérêt (GOI) lors de l'infection. SNP sont issus de clones d'ADNc de virus à ARN transmis par les moustiques (genre Alphavirus; famille des Togaviridae). Le genre Alphavirus contient environ 30 espèces différentes de virus transmis par les moustiques. Alphavirus sont des virus enveloppés et contiennent un seul brin génomes ARN (~ 11,7 Kb). Alphavirus transcrire un ARNm sous-génomiques qui code les protéines structurales du virus nécessaire à l'encapsidation du génome et de la maturation du virus. Alphavirus sont généralement très lytique dans les cellules de vertébrés, mais persistante infecter les cellules de moustique sensible avec un minimum de cytopathologie. Ces attributs rendent d'excellents outils pour l'expression des gènes dans les moustiques vecteurs. Le SNP les plus couramment utilisés sont dérivés de virus Sindbis (SINV). Le tropisme espèces éventail de SINV permet d'infection des cells8 insectes, oiseaux et mammifères. Toutefois, les SNP ont été tirés autres alphavirus ainsi 9,10,20. L'expression des gènes étrangers est rendue possible par l'insertion d'un site supplémentaire subgénomiques virale ARN d'initiation ou de promoteur. SNP dans lequel une séquence d'un gène exogène est placé à 5 'de la structure des gènes viraux est utilisé pour l'expression des protéines stables chez les insectes. SNP, dans lequel une séquence d'un gène est positionné 3 'des gènes de structure, est utilisé pour déclencher l'expression de RNAi et le silence de ce gène dans l'insecte.
SNP se sont révélés être des outils précieux pour la compréhension des interactions vecteur-pathogène, les détails moléculaires de la réplication virale et des cycles de maintenance infectieuses 3,4,11,19,21. En particulier, l'expression de journalistes fluorescentes et bioluminescents a joué un rôle de suivi de l'infection virale dans la transmission du virus vecteur et 5,14-16,18. De plus, la réponse immunitaire de vecteurs a été décrit en utilisant deux souches de SINV pour exprimer la GFP 2,9.
Ici, nous présentons une méthode pour la production de SINV contenant un journaliste fluorescente (GFP) à partir du clone d'ADNc infectieux. Infectieuses, pleine longueur ARN est transcrit à partir du clone d'ADNc linéarisées. ARN infectieux est introduit dans les cellules cibles permissives par électroporation. Les cellules transfectées générer des particules virales infectieuses exprimant l'IGE. Virus récolté est utilisé pour infecter les moustiques, telles que décrites ici, ou d'autres espèces hôtes (non représenté ici). Compétence vectorielle est évaluée par la détection de fluorescence à l'extérieur de l'intestin moyen ou par la transmission du virus de surveillance 7. Utilisation d'un rapporteur fluorescent que les pouvoirs publics indiens permet d'estimer facilement la propagation du virus à travers une culture cellulaire, pour la détermination du taux d'infection, la diffusion des moustiques exposés, la transmission du virus du moustique et fournit un indicateur rapide de la compétence vectorielle.
Protocol
Le protocole suivant est écrit pour la production et l'utilisation d'un ATS fondée sur le virus Sindbis MRE16. L'ATS est conçu pour exprimer la GFP dans le moustique vecteur Aedes aegypti. ADNc clones infectieux d'un certain nombre d'alphavirus (virus Sindbis, virus Chikungunya, O'nyong-Nyong, le virus de l'encéphalite équine de l'ouest) sont actuellement disponibles qui ont été conçus comme des ATS (tableau 1). Pour de meilleurs résultats ADN plasmidique est amplifié dans des bactéries telles que VOUS bactéries compétentes (Stratagene / Agilent Technologies) afin d'éviter la recombinaison indésirables et la perte de l'ADNc viral. Tous les plasmides clone infectieux ont un bacteriophage T7 ou SP6 promoteur lors de la 5 immédiate "fin de l'ADNc viral pour la transcription de l'ARN génomique pleine longueur et une endonucléase de restriction unique à l'extrémité 3 'de la transcription du ruissellement. Pour chaque SNP, les utilisateurs doivent utiliser l'ADN approprié bactériophage dépendante de l'ARN polymérase et l'endonucléase de restriction unique pour transcription in vitro de l'ARN génomique viral.
1. Génération de l'ARN du clone d'ADNc infectieux.
- Linéariser le 5 ug du clone infectieux plasmide (p5'dsMRE16 / GFP) avec 20 unités d'enzyme de restriction XhoI dans une réaction de 100 ul. Incuber pendant 2-3h à 37 ° C
- Purifier l'ADN linéarisé en utilisant Qiagen QIAprep Spin Miniprep Kit protocole de purification de remplacement, en éluant d'ADN de colonne de centrifugation avec 50 uL d'eau sans RNase. La concentration plasmidique devrait être d'environ 1,0 ug / uL.
- Dans un tube sans RNase de 0,2 ml par PCR, mise en place d'une réaction de transcription 50 uL utilisant Ambion MAXIscript kit par le protocole comme suit.
- 22,5 uL RNase dH 2 O
- 5.0 template uL ADN linéarisé (1,0 ug / uL)
- 2,5 ul 10mM ATP
- 2,5 ul 10mM CTP
- 2,5 ul 10mM UTP
- 2,5 ul 1mM GTP
- 2,5 ul 10mM bouchon analogique (m 7 G (5 ') ppp (5') G)
- 5,0 pi de tampon de transcription 10X
- 5,0 uL T7 ou SP6 mélange de polymérase
- 50,0 Total uL
- 22,5 uL RNase dH 2 O
- Incuber la réaction de transcription pendant 1 heure à 37 ° C. Après incubation, la réaction doit être utilisé immédiatement pour l'électroporation des cellules BHK-21. Préparation des cellules BHK-21 pour l'électroporation devrait commencer au cours de réaction de transcription d'incubation.
2. Génération du virus à partir d'ARN infectieuses
- Trypsiniser deux confluents de 70-80% à 150 cm 2 (T-150) flacon cellules BHK-21 par l'ATS.
- Transférer toutes les cellules dans un tube de 15 ml à centrifuger conique.
- Pellet les cellules par centrifugation à 2000 rpm, 10 min, 4 ° C dans une centrifugeuse de table conventionnelle.
- Resuspendre les cellules dans du PBS stérile, sans Mg + + et Ca + +. Répétez les étapes 2.3 et 2.4 jusqu'au cellules ont été lavées trois fois avec du PBS.
- Reprendre le granulé cellules MEM 0,5 ml contenant 10% de FBS.
- Diluer 10 cellules avec 90 uL MEM uL avec 10% de FBS et compter sur un hématimètre. Si nécessaire, les cellules diluer à 2.5 au 12.5 x 10 7 cellules / ml avec du MEM contenant 10% de FBS.
- Pour une glace froide 0,2 cm cuvette d'électroporation, ajouter 400 cellules en suspension et 20 uL réaction de transcription ul. Essuyez la condensation de la cuvette.
- Impulsion de la cuvette deux fois: 450V, 1200Ω, 150 pF. Nous utilisons une cellule électro Manipulateur, Harvard Apparatus modèle ECM630.
- Placez le contenu de la cuvette dans un flacon de 25 cm 2 de culture de tissus contenant 5 ml MEM avec 10% de FBS.
- Incuber flacon (s) à 37C avec 5% de CO 2.
- Surveiller l'infection quotidienne à l'aide d'un microscope inversé fluorescent avec ensemble de filtres appropriés (par exemple la GFP filtre: longueur d'onde d'excitation = 460-490 nm, longueur d'émission = 510 à 550 nm, ou DsRed filtre: longueur d'onde d'excitation = 460-560 nm, longueur d'onde d'émission => 590 nm).
- Lorsque l'infection est la fluorescence suggère confluentes et / ou CPE est visible partout dans le flacon, de recueillir le contenu de la fiole, ajouter 30% de FBS, partie aliquote que nécessaire, et conserver à -80 ° C. Si désiré, lysats de cellules peut être clarifié par centrifugation (2000 rpm, 10 min, 4 ° C) avant l'addition de FBS.
- Passage de virus au moins une fois par un nouveau flacon de cellules pour augmenter le titre du virus pour les dosages ultérieurs nourrir de sang.
3. Per os infection des moustiques
- Mélanger le sang (généralement achetés sang de mouton de-fibrinated) et de culture de cellules de suspension de virus provenant de l'étape 2.13. Titre du virus dans le final le repas de sang normalement devrait être ~ 1x10 7 unités formant plaque (UFP) / ml pour une infection intestin moyen efficace de le moustique. Afin de stimuler les moustiques pour engorger, l'adénosine 5'-triphosphate (ATP) peut être ajoutée à une concentration finale de 0,02 M.
- Les moustiques peuventdoivent être privés d'eau et de sucre avant l'infection à les stimuler pour nourrir efficacement le sang à partir d'un chargeur artificielle. Durée de la privation doit être préalablement mis en place pour minimiser la mortalité. Les temps dépendra de l'espèce de moustique, l'humidité de l'insectarium etc Comme point de départ, enlever le sucre et 24h à 12h l'eau avant de l'alimentation. Ce protocole utilise chemise d'eau en verre avec feeders17 circulant à 37 ° C l'eau. Une membrane intestinale porcine (c'est à dire lavés saucisses boîtier disponible à la plupart des épiceries) est placé sur la bouche de l'alimentation et le repas est à la pipette dans la chambre. Différentes conceptions, les membranes et les protocoles sont disponibles pour les types de vecteurs différents.
- Les moustiques sont triées pour ne sélectionner que les moustiques gorgées de sang. Moustiques gorgés sont transférés à un carton avec organdi sur le dessus et les moustiques sont incubées à 28 ° C, 75-80% d'humidité relative jusqu'à traitées pour expression de la GFP.
4. L'inoculation intrathoracique des moustiques
L'inoculation intrathoracique est une méthode alternative pour infecter les arthropodes. Cette méthode est utilisée lorsque la diffusion par le biais de l'intestin moyen n'est pas nécessaire. (Méthode décrite ci-dessous, mais la technique n'est pas démontré dans cette expérience visuelle).
- Un petit nombre de moustiques (5-10) est aspiré par les cages en plastique de maintien dans les tubes de maintien. Les tubes scellés holding sera placé à 4 ° C pendant 15 min pour refroidir les moustiques.
- 2 5 moustiques sera versé à partir du tube sur un plat en verre de Pétri reposant sur la glace. Placer le couvercle sur la boîte de Pétri lorsqu'il n'est pas utilisé ou si les moustiques commencent à se déplacer. Pendant la manipulation des moustiques, il faut prendre soin de compter et de garder trace du nombre de moustiques d'être manipulé. Comme les moustiques sont déversés sur la table de refroidissement, le nombre total seront enregistrées sur un compteur de laboratoire.
- L'aiguille est préparé par fusion tube capillaire en verre à l'aide Nanoject spécifiques et un extracteur d'aiguilles.
- Configuration du Nanoject II microinjecteur selon les instructions du fabricant pour la livraison de 69 nL d'inoculum. Il faut être prudent lors de l'élaboration de l'inoculum dans l'aiguille pour que l'aiguille n'est pas endommagé.
- En utilisant un microscope à dissection, insérer l'aiguille dans le thorax du moustique et d'activer le Nanoject pour l'inoculation. Des précautions doivent être prises lors de l'inoculation des moustiques afin que l'aiguille n'a pas pénétrer complètement le moustique et la sortie de l'autre côté, ce qui entraîne la mort subséquente du moustique. Vérifiez chaque moustique pour être sûr que l'inoculum est entré avant de le retirer de l'aiguille.
- Après l'inoculation, tandis que le moustique est encore empalé sur l'aiguille, le placer dans un carton de papier tenant travers un petit trou dans le côté qui est bouché avec du coton ou un bouchon de liège à tout autre moment.
- Lorsque les moustiques ont ensemencé et placé dans le carton (jusqu'à environ 50 par carton), soigneusement bandes du liège en place pour prévenir la libération accidentelle de moustiques. Placez les cartons dans une poubelle maintenant sécurisé avant d'incubation plus loin dans l'insectarium à 28 ° C% d'humidité et 80 relatives.
5. Infection Surveillance des moustiques
- Placez le papier carton maintien à 4 ° C pendant environ 15 minutes pour immobiliser les moustiques.
- Transfert d'un petit nombre de moustiques (5-10 à la fois) à une table de froid adaptée pour une utilisation sur un microscope à fluorescence.
- Examiner et trier les moustiques basée sur la présence ou l'absence de fluorescence. En outre, les fluorescents intensité peut être utilisé comme une mesure quantitative de l'infection par procuration. Mosquito tissus tels que estomacs, les glandes salivaires, la graisse corporelle peut être disséqué et surveillées pour la fluorescence.
- Le cas échéant, le retour des moustiques choisi pour carton de papier pour continuer d'incubation de moustiques infectés.
6. Essai de transmission (salivation obligée de manifester la transmission du virus)
- Priver les moustiques de la source de sucre pendant 24 h avant de se nourrir.
- Retirer les jambes et les ailes
- Pour un 50 tube capillaire uL qui a été chauffé, tiré et ciselée à une extrémité, ajouter 3-5 uL d'Cargille type huile d'immersion B ou 10% de sérum-saccharose solution.
- Insérez la trompe dans le tube. Si vous utilisez l'huile, les gouttelettes de salive sera vu à exsuder de la trompe. Un uL d'une solution pilocarbine 1% dans du PBS et 0,1% de Tween 80 peut être appliqué au thorax à stimuler.
- Après 60-90 minutes, enlever les moustiques et magasin pour l'isolement du virus, si nécessaire.
- Retirer solution du tube par centrifugation dans un tube contenant 100 uL 20% de FBS-PBS.
- Filtre stérile de l'inoculum à travers un filtre seringue de 0,2 um, puis utiliser la filtrée de l'inoculum pour infecter les cellules cultivées.
REMARQUE BIOSECURITE: Ce protocole décritune méthode pour générer, identifier, et le suivi des moustiques infectés. Basé sur vos installations (c.-à une table de refroidissement, des installations de confinement, etc) et à l'approbation du BAC, vous pouvez être limité à leur seul examen après avoir enlevé les ailes et les jambes pour empêcher la fuite. SINV basé ATS peuvent être générés et utilisés dans un environnement BSL2. L'utilisation de l'ATS est basé sur d'autres alphavirus tels que le Chikungunya virus ou virus de l'encéphalite équine, il faudra BSL3 installations.
7. Les résultats représentatifs
Un aperçu de l'expression d'un gène marqueur (GFP) en utilisant le 5'dsMRE16 ATS / GFP est montré dans la figure 1. Expression de la GFP dans les cellules BHK-21 et C6/36 (Aedes albopictus) cellules est illustré à la figure 2 à des moments précis après l'infection des cellules avec 5'dsMRE16 / GFP virus à 0,01 multiplicité d'infection. La figure 3 est une vue d'ensemble de l'infection virale d'alphavirus et ATS dans le moustique, lorsque le virus est livré par un repas de sang infectieux. La figure 4 montre la préparation d'un repas de sang avec ~ 10 7 pfu / ml de virus ATS suivie par une infection orale d'Aedes aegypti. Vue d'ensemble du corps moustique infecté et les parties du corps sélectionné à 10 jours après l'infection en utilisant un microscope à épifluorescence (Figure 5). La détection de la GFP et dsRED en estomacs de moustiques infectés suite à une infection avec des virus exprimant ATS 5'dsMRE16 chaque gène marqueur fluorescent (figure 6). Test de transmission utilisant des moustiques infectés par 5'dsMRE16 / GFP ATS virus (figure 7).
Tableau 1. ATS est actuellement conçu pour l'expression des gènes chez les moustiques.
| Alphavirus | ATS | Moustiques | Référence |
| Virus Sindbis | TE / 3'2J et TE / 5'2J | Aedes aegypti | 12 |
| Ochlerotatus triseriatus | 13 | ||
| 3'dsMRE16 et 5'dsMRE16 | A. aegypti | 5 | |
| Culex tritaeniorhynchus | 5 | ||
| 5'dsTR339 | A. AEG ypti | 2 | |
| Le virus Chikungunya | 3'dsCHIKV et 5'dsCHIKV | A. aegypti / A. albopictus | 20 |
| O'nyong Nyong virus | 5'dsONNV | Anopheles gambiae | 1,9 |
| Le virus de l'encéphalite équine occidentale | 5'dsWEEV. McMillan | Culex tarsalis | Stauft et al., Inédit |
Tableau 2. Avantages / inconvénients de l'utilisation ATS pour l'expression des gènes chez les moustiques.
| Avantages: |
| Production rapide de titre élevé de virus |
| Large gamme d'hôtes (SINV) |
| Taux élevé de réplication de l'ARN |
| Des taux élevés de l'expression du transgène |
| Relative facilité de manipulation des gènes |
| Stable, l'expression des gènes persistants dans les insectes |
| Minimal pathologie des insectes |
| Inconvénients: |
| Mode d'expression à court terme dans les cellules de vertébrés |
| Forte des effets cytopathiques sur les cellules de vertébrés |
| Restrictions de taille Gene (<1 Ko, idéalement) |
| Certains nécessitent alphavirus BSL3 confinement |
Figure 1: Vue d'ensemble de la production de virus ATS cellules BHK-21 en utilisant p5'dsMRE / GFP GFP SINV exprimer. Après transcription in vitro, génomique ATS ARN est une électroporation dans les cellules BHK-21 où le virus est sauvé. Le virus ATS peut alors être utilisé pour infecter les moustiques. PSC = promoteur subgénomique. Trois espèces d'ARN ATS sont transcrits dans le CELls, le génomiques, subgénomiques 1 et 2 ARN subgénomiques. C (capside), glycoprotéines E2 et E1 sont assemblés avec ATS génome pour générer un virus infectieux.
Figure 2: Expression de la GFP dans les moustiques (C6/36), les cellules après infection par SINV 5'dsMRE16 / GFP virus.
Figure 3: Aperçu d'une infection par le virus chez les moustiques ATS menant à la transmission du virus.
Figure 4: ATS SINV 5'dsMRE16 infection par exposer les moustiques à un repas de sang infectieux.
Figure 5: ATS SINV 5'dsMRE16 / GFP infection à 10 jours après l'infection. La détection du corps entier de la GFP montre que le virus s'est échappé de l'intestin et diffusé aux tissus secondaires. La figure montre aussi l'expression de GFP dans les parties du corps sélectionné qui est aussi révélatrice d'une infection disséminée.
Figure 6: ATS SINV 5'dsMRE16 / GFP et 5'dsMRE16 / infection dsRED des estomacs à des moments précis après l'infection. Estomacs ont habituellement des foyers distincts d'infection précoce après l'ingestion d'un virus repas de sang contenant qui se propage dans l'intestin moyen postérieure à des moments plus tard, après l'infection.
Figure 7: Détection des ATS 5'dsMRE16 / GFP dans la salive de moustiques dès 8 jours après l'infection. Test est destiné à montrer la transmission du virus ATS et montre que le virus 5'dsMRE16 / GFP peut expriment de façon stable la GFP pendant toute la période d'incubation extrinsèque chez le moustique. Le panneau de gauche montre un moustique saliver dans un tube capillaire, le panneau central montre C6/36 cellules infectées avec de la salive à 1 jour et panneau de droite 3 jours après l'infection.
Discussion
Les méthodes présentées ici permettent aux chercheurs de suivre l'infection d'un alphavirus de la culture de cellules de moustique et le moustique femelle adulte. Les avantages et les inconvénients de l'utilisation des virus ATS sont résumées dans le Tableau 2. Un SNP clone infectieux peuvent être manipulées génétiquement pour exprimer toute GOI et ont été utilisés pour exprimer des anticorps à chaîne simple, des suppresseurs de RNAi, ARN antisens ciblant les gènes endogènes, et pro-apoptotiques des protéines. Si un journaliste n'est pas utilisé, alors la portion de cette méthode d'imagerie n'est pas pertinente. Cependant, la plupart des mêmes protocoles sont nécessaires pour le sauvetage du virus ATS, la propagation et l'infection des moustiques. Il ya des limites à la taille maximale du transgène lorsqu'il est inséré dans un système de transduction alphavirus. Les contraintes de taille varient en fonction de la souche parentale utilisée pour produire de l'ATS, mais sont généralement d'environ 1kb bien gènes rapporteurs grands tels que la luciférase de luciole ont été utilisés dans la construction d'ATS pour une utilisation chez les moustiques. Les laboratoires de recherche avec une quantité modeste de fond de virologie devraient être en mesure d'utiliser ATS suivant ces protocoles. Un certain nombre de laboratoires de recherche ont déjà fait à l'aide SINV basé ATS.
Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Ce travail est soutenu par le National Institutes of Health (NIH R01 AI46435) et le RMRCE (NIH AI065357).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
| MAXIscript Kit | Ambion | AB1312 | Be sure to use a kit containing the appropriate polymerase for your construct. |
| Cap Analogue (m7G(5’)ppp(5’)G) | Ambion | AM8050 | |
| Nanoject II nanoliter injector | Drummond Scientific | 3-000-204 | |
| Electro Cell Manipulator | Harvard Apparatus | ECM 630 |
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