Summary
En este artículo se describe la cultura de los cortes de tejido de pacientes para estudios de administración de genes y el posterior análisis de la expresión génica mediante imágenes de bioluminiscencia IVIS.
Abstract
Este vídeo describe el uso de tejido de un paciente como un modelo ex vivo para el estudio de la administración de genes. Tejido fresco obtenido del paciente en el momento de la cirugía se rebana y se mantienen en cultivo. El sistema vivo ex modelo permite la entrega física de los genes en el tejido del paciente intacto y la expresión de genes es analizado por imágenes de bioluminiscencia utilizando el sistema de detección de IVIS. El sistema de detección bioluminiscentes demuestra la cuantificación rápida y precisa de la expresión génica dentro de sectores individuales sin necesidad de sacrificar tejido. Este tejido rebanada sistema de cultivo puede ser utilizado en una variedad de tipos de tejidos incluyendo los tejidos normales y malignos, y nos permite estudiar los efectos de la naturaleza heterogénea del tejido intacto y el alto grado de variabilidad entre los pacientes individuales. Este modelo de sistema se podría utilizar en ciertas situaciones, como una alternativa a los modelos animales y como un modo complementario preclínicas antes de entrar en ensayos clínicos.
Protocol
Preparación de medios y reactivos
- Solución de antibióticos
Tampón fosfato salino (PBS) con 200 U / ml de penicilina, 200 mg / ml de estreptomicina, 5 mg / ml fungizone - Recogida y tratamiento de soporte
Dulbecco Eagle modificado (DMEM) con 200 U / ml de penicilina, 200 mg / ml de estreptomicina, 5 mg / ml fungizone - Medio de cultivo
Medio de colección que contiene 10% inactivado por calor suero fetal bovino
I. colección de tejidos y de almacenamiento
Aprobación para la recolección de tejido del paciente se obtuvo de la Investigación Clínica del Comité de Ética de los hospitales de Cork enseñanza y se obtuvo el consentimiento de los pacientes el día antes de la cirugía. Tejido hepático se obtuvo de los pacientes sometidos a hepatectomía parcial de una enfermedad maligna.
- Tejido fresco de pacientes se obtiene en el momento de la resección quirúrgica.
- Tejido se almacena en los medios de recolección a 4 ° C (tejidos pueden conservarse refrigeradas hasta por 12 horas sin pérdida significativa de viabilidad, sin embargo el procesamiento inmediato es recomendable).
II. Tejido rebanada preparación y la cultura
Rebanar se realizó con un vibratome (Leica, Alemania). El sistema de corte de tejido se utilizó de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Preparación de tejidos corte se llevó a cabo bajo una campana estéril utilizando instrumentos limpiados con un 70% 2-propanol. Grosor de corte se fija en 2.000 micrones y cortar con una cuchilla de vaivén a 22-26 rpm.
- El tejido se lava en una solución antibiótica en tres ocasiones.
- Tejido es fijado a la etapa de montaje con adhesivo no tóxico (Dermabond).
- Grosor de corte se fija y el corte se realiza en 22 a 26 rpm.
- Los sectores se mantienen en medio de cultivo en placas de cultivo de 6 pocillos (una rebanada por pocillo) a 37 ° C con 5% de CO 2 en un ambiente húmedo.
III. Gen de entrega de cortes de tejido
- Los sectores se pre-incubaron a 37 º C durante 2 h antes del tratamiento.
- El medio de cultivo se sustituye por medio de tratamiento.
- Los sectores se inyecta directamente con el vector viral (25 l de partículas virales Ad5.CMVluc [1x10 9]). Por otra parte, las partículas pueden ser añadidos al medio, para la infusión pasiva.
- Después de dos horas de incubación, añadir suero al medio.
IV. Análisis de la expresión génica mediante el análisis bioluminiscente
- Los sectores se inyectaron 100 l de sustrato luciferina (3 mg / ml).
- 6-así placa de cultivo se coloca en el escenario y se incubó durante 10 min.
- Los sectores se fotografió por 5 min a alta sensibilidad (Figura 1).
V. Los resultados representativos
Figura 1. Imágenes bioluminiscentes de cortes de hígado de pacientes con sistema de detección de IVIS.
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Discussion
Se describe un paciente ex vivo de tejidos método de cultivo y sistema de detección de bioluminiscencia para la evaluación de la entrega de genes dentro de no fija el tejido humano. El método ofrece una forma simple y reproducible de los cortes de tejido de cultivo. Tiene un potencial significativo, ya que permite el estudio de la administración de genes en el tejido humano intacto, el análisis de la entrega de genes en una variedad de tejidos humanos, incluidos los tejidos malignos y pueden proporcionar información importante sobre los efectos del alto grado de variabilidad entre los pacientes con respecto a la captación de genes. Diferentes tipos de cáncer pueden tener diferentes influencias sobre la eficacia de las diferentes etapas de la expresión del transgén en las células de éxito, con la participación absorción del ADN y la transcripción y la traducción posterior. Estos pasos se describen en la animación de vídeo, utilizando el vector viral como un ejemplo. El sistema de detección bioluminiscentes demuestra la cuantificación rápida y precisa de la expresión génica dentro de sectores individuales sin necesidad de sacrificar tejido. De vectores de replicación incompetente, como empleados en este estudio, la luminiscencia está directamente relacionada con la expresión de genes en las células.
Este modelo de sistema proporcionará información valiosa acerca de la entrega de genes en el tejido del paciente antes de entrar en el juicio clínico.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Este trabajo fue financiado a través del sur de Cork Hospital Victoria de fondos del Hospital Universitario de mama, la Sociedad del Cáncer de Irlanda (CRI07TAN) y el Centro de Investigación del Cáncer Cork. Replicación incompetente adenovirus recombinante partículas de 5 bajo el control transcripcional del promotor de CMV fue una especie de regalo del profesor Andrew Baker, de la Universidad de Glasgow.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6429 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Firefly Luciferin | Biosynth International, Inc | ||
| Dermabond | Johnson & Johnson | ||
| Vibrotome | Leica Microsystems | VT 1000 A |
References
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