Summary
इस लेख जीन डिलीवरी अध्ययन और जीन अभिव्यक्ति के बाद विश्लेषण IVIS bioluminescence इमेजिंग का उपयोग के लिए रोगी के ऊतकों स्लाइस की संस्कृति का वर्णन करता है.
Abstract
इस वीडियो जीन डिलीवरी के अध्ययन के लिए एक पूर्व vivo मॉडल के रूप में रोगी ऊतक के उपयोग का वर्णन करता है. ताजा मरीज सर्जरी के समय में प्राप्त ऊतक कटा हुआ है और संस्कृति में बनाए रखा है. पूर्व vivo मॉडल प्रणाली बरकरार मरीज के ऊतकों और जीन अभिव्यक्ति bioluminescence IVIS पहचान प्रणाली का उपयोग इमेजिंग द्वारा विश्लेषण किया है में जीन की भौतिक प्रसव के लिए अनुमति देता है . bioluminescent पहचान प्रणाली ऊतक बलिदान के लिए आवश्यकता के बिना व्यक्तिगत स्लाइस के भीतर जीन अभिव्यक्ति के तेजी से और सही मात्रा का ठहराव को दर्शाता है. यह टुकड़ा टिशू कल्चर प्रणाली सामान्य और घातक ऊतक सहित ऊतक प्रकार के एक किस्म में इस्तेमाल किया जा सकता है और हमें बरकरार ऊतक के विषम प्रकृति और व्यक्ति के रोगियों के बीच परिवर्तनशीलता के उच्च डिग्री के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए अनुमति देता है. इस मॉडल प्रणाली के पशु मॉडल के लिए एक विकल्प के रूप में और एक पूरक के लिए चिकित्सीय परीक्षण में प्रवेश preclinical पूर्व मोड के रूप में कुछ स्थितियों में इस्तेमाल किया जा सकता है.
Protocol
मीडिया और अभिकर्मकों की तैयारी
- एंटीबायोटिक समाधान
फास्फेट 200 यू / एमएल पेनिसिलिन, स्ट्रेप्टोमाइसिन 200 / μg मिलीलीटर, 5 μg / एमएल fungizone के साथ खारा (पीबीएस) buffered - संग्रह और उपचार मध्यम
200 यू / एमएल पेनिसिलिन के साथ Dulbecco संशोधित ईगल (DMEM) मध्यम, 200 / μg मिलीलीटर स्ट्रेप्टोमाइसिन, 5 μg / एमएल fungizone - संस्कृति के माध्यम
संग्रह मध्यम 10% युक्त गर्मी निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय सीरम
मैं ऊतक संग्रह और भंडारण
मरीज के ऊतकों संग्रह के लिए स्वीकृति कॉर्क शिक्षण अस्पतालों के क्लीनिकल रिसर्च आचार समिति से प्राप्त किया गया था और सूचित सहमति सर्जरी से पहले दिन के रोगियों से प्राप्त हुई थी. जिगर ऊतक घातक रोग के लिए आंशिक hepatectomy के दौर से गुजर रोगियों से प्राप्त हुई थी.
- ताजा रोगी ऊतक शल्य लकीर के समय में प्राप्त की है.
- ऊतक संग्रह मीडिया में 4 पर संग्रहीत किया जाता है डिग्री सेल्सियस (ऊतक व्यवहार्यता की महत्वपूर्ण नुकसान के बिना 12 घंटे के लिए प्रशीतित संग्रहीत हो सकता है, लेकिन तत्काल प्रसंस्करण की सिफारिश की है).
द्वितीय. ऊतक टुकड़ा तैयारी और संस्कृति
टुकड़ा करने की क्रिया एक vibratome (Leica, जर्मनी) का उपयोग किया गया था. ऊतक टुकड़ा करने की क्रिया प्रणाली निर्माता के निर्देशों के अनुसार इस्तेमाल किया गया था. ऊतक टुकड़ा तैयारी एक बाँझ हुड के नीचे 70% 2-propanol के साथ साफ उपकरणों का उपयोग किया गया था. स्लाइस की मोटाई 2000 microns पर सेट है और 22-26 rpm पर एक reciprocating ब्लेड का उपयोग कर में कटौती.
- ऊतक एंटीबायोटिक समाधान में तीन बार धोया जाता है.
- ऊतक बढ़ते चरण गैर विषैले चिपकने वाला (Dermabond) का उपयोग करने के लिए जुड़ा हुआ है.
- स्लाइस मोटाई सेट और टुकड़ा करने की क्रिया 22-26 rpm पर हासिल की है.
- स्लाइसें संस्कृति माध्यम में 6 अच्छी तरह से संस्कृति व्यंजन (अच्छी तरह से प्रति एक टुकड़ा) में 37 में रखा जाता है डिग्री सेल्सियस humidified वातावरण में 5% सीओ 2 के साथ .
III. ऊतकों स्लाइस के लिए जीन डिलीवरी
- स्लाइसें हैं 37 ° सी 2 घंटे के लिए उपचार से पहले पूर्व incubated.
- संस्कृति मध्यम उपचार के माध्यम से बदल दिया है.
- स्लाइसें सीधे वायरल Ad5.CMVluc (वायरल कणों के 25 μl [9 1x10]) वेक्टर. के साथ अंतःक्षिप्त रहे हैं वैकल्पिक रूप से, कणों के माध्यम से जोड़ा जा सकता है निष्क्रिय जलसेक के लिए.
- ऊष्मायन के दो घंटे के बाद, सीरम माध्यम से जोड़ा जाता है.
चतुर्थ. जीन अभिव्यक्ति के bioluminescent विश्लेषण द्वारा विश्लेषण
- स्लाइसें luciferin सब्सट्रेट (3 मिलीग्राम / एमएल) की 100 μl के साथ अंतःक्षिप्त रहे हैं.
- 6-अच्छी तरह से संस्कृति डिश मंच पर रखा गया है और 10 मिनट के लिए incubated.
- स्लाइसें उच्च संवेदनशीलता (चित्रा 1) पर 5 मिनट के लिए imaged हैं.
वी. प्रतिनिधि परिणाम
चित्रा 1 रोगी जिगर IVIS पहचान प्रणाली का उपयोग स्लाइस की bioluminescent इमेजिंग.
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Discussion
हम एक पूर्व vivo रोगी टिशू कल्चर विधि और गैर तय मानव ऊतक के भीतर जीन डिलीवरी के मूल्यांकन के लिए bioluminescent पहचान प्रणाली का वर्णन . विधि संवर्धन ऊतक स्लाइस के एक सरल और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य तरीका उपलब्ध कराता है. यह महत्वपूर्ण क्षमता है के रूप में यह घातक ऊतक सहित मानव ऊतक के एक किस्म में बरकरार मानव ऊतकों में जीन डिलीवरी जीन डिलीवरी के विश्लेषण का अध्ययन की अनुमति देता है और सम्मान के साथ व्यक्ति के रोगियों के बीच परिवर्तनशीलता के एक उच्च डिग्री के प्रभाव के विषय में महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान कर सकते हैं जीन तेज करने के लिए. विभिन्न प्रकार के कैंसर कोशिकाओं में सफल transgene अभिव्यक्ति के विभिन्न चरणों की प्रभावकारिता पर प्रभाव अलग हो सकता है, डीएनए तेज और बाद प्रतिलेखन और अनुवाद से जुड़े. इन चरणों का वीडियो एनीमेशन में रेखांकित कर रहे हैं, एक उदाहरण के रूप में वायरल सदिश का उपयोग. bioluminescent पहचान प्रणाली ऊतक बलिदान के लिए आवश्यकता के बिना व्यक्तिगत स्लाइस के भीतर जीन अभिव्यक्ति के तेजी से और सही मात्रा का ठहराव को दर्शाता है. प्रतिकृति जैसे इस अध्ययन में कार्यरत अक्षम वैक्टर, के लिए, luminescence कोशिकाओं द्वारा जीन अभिव्यक्ति के लिए सीधे संबंधित है.
इस मॉडल प्रणाली मूल्यवान जीन रोगी के ऊतकों को प्रसव में प्रवेश चिकित्सीय परीक्षण के लिए पहले के बारे में जानकारी प्रदान करेगा.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
इस काम कॉर्क दक्षिण दुर्बलता विक्टोरिया विश्वविद्यालय अस्पताल स्तन निधि, आयरिश कैंसर सोसायटी (CRI07TAN) और कॉर्क कैंसर रिसर्च सेंटर के माध्यम से वित्त पोषित किया गया था. प्रतिकृति अक्षम सीएमवी प्रमोटर के transcriptional नियंत्रण के तहत पुनः संयोजक adenovirus 5 कणों प्रो एंड्रयू बेकर, ग्लासगो विश्वविद्यालय से एक तरह का उपहार था.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6429 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Firefly Luciferin | Biosynth International, Inc | ||
| Dermabond | Johnson & Johnson | ||
| Vibrotome | Leica Microsystems | VT 1000 A |
References
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