Summary
Denna artikel beskriver kulturen i patientens vävnad skivor för studier gen leverans och efterföljande analys av genuttryck med hjälp IVIS bioluminescens avbildning.
Abstract
Denna video beskriver användningen av patientens vävnad som en ex vivo-modell för studier av genen leverans. Färska patientens vävnad som erhålls vid tidpunkten för ingreppet är skivad och upprätthålls i kulturen. Den ex vivo modellsystem gör det möjligt för den fysiska leveransen av gener i intakta patientens vävnad och genuttryck analyseras av mareld avbildning med IVIS detektionssystem. Den självlysande system för upptäckt visar snabb och exakt kvantifiering av genuttryck inom enskilda skivor utan att behöva vävnaden offer. Denna skiva vävnadskultur system kan användas i en mängd olika vävnadstyper, inklusive normala och maligna vävnad och ger oss möjlighet att studera effekterna av heterogena karaktär intakt vävnad och den höga graden av variation mellan enskilda patienter. Denna modell system skulle kunna användas i vissa situationer som ett alternativ till djurmodeller och som en kompletterande prekliniska läge före inträde klinisk prövning.
Protocol
Beredning av medier och reagenser
- Antibiotika Lösning
Fosfatbuffrad saltlösning (PBS) med 200 U / ml penicillin, 200 mikrogram / ml streptomycin, 5 mikrogram / ml fungizone - Insamling och behandling medelstora
Dulbecco ändrade eagle medium (DMEM) med 200 U / ml penicillin, 200 mikrogram / ml streptomycin, 5 mikrogram / ml fungizone - Odlingsmedium
Insamling medium som innehåller 10% värmeinaktiveras fetalt bovinserum
I. Tissue insamling och lagring
Godkännande för patientens vävnad samling har erhållits från kliniska forskningscentrum etikkommitté sjukhus Cork Undervisning och informerat samtycke erhölls från patienterna dagen före operationen. Levervävnad har erhållits från patienter som genomgår partiell hepatektomi för malign sjukdom.
- Färska patientens vävnad erhålls vid kirurgisk resektion.
- Tissue lagras i samlingen medier vid 4 ° C (Tissue kan förvaras i kylskåp i upp till 12 h utan betydande förlust av livskraft, är dock omedelbar bearbetning rekommenderas).
II. Tissue skiva förberedelse och kultur
Skivning genomfördes med en vibratome (Leica, Tyskland). Vävnaden skivning system användes enligt tillverkarens anvisningar. Tissue slice förberedelser utfördes under en steril köksfläkten med instrument rengörs med 70% 2-propanol. Slice tjocklek är satt till 2000 micron och skär med en fram-och återgående blad på 22-26 rpm.
- Tissue tvättas i antibiotiska lösning tre gånger.
- Tissue är fäst vid montering steg med icke-giftiga lim (Dermabond).
- Slice tjocklek är inställd och skivning uppnås vid 22-26 rpm.
- Skivor hålls i substratet i 6-såväl kultur rätter (en skiva per brunn) vid 37 ° C med 5% CO 2 i en fuktig miljö.
III. Gene leverans till vävnad skivor
- Skivor är förinställda inkuberas vid 37 ° C under 2 timmar före behandling.
- Odlingsmedium ersätts med behandling medium.
- Segment är direkt injiceras med virala vektorer (25 ìl av viruspartiklar Ad5.CMVluc [1x10 9]). Alternativt kan partiklar läggas till mediet, för passiva infusion.
- Efter två timmars inkubation är serum tillsätts medium.
IV. Analys av genuttryck med självlysande analys
- Segment injiceras med 100 ìl luciferin substrat (3 mg / ml).
- 6-bra kultur maträtt placeras på scenen och inkuberas i 10 min.
- Skivor är avbildade i 5 min med hög känslighet (Figur 1).
V. representativa resultat
Figur 1. Bioluminescent avbildning av patientens lever-skivor med hjälp av IVIS detektionssystem.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi beskriver en ex vivo patienten metod vävnadsodling och självlysande detektionssystem för bedömning av genen leverans inom icke fasta mänsklig vävnad. Metoden erbjuder ett enkelt och reproducerbart sätt skivor odling vävnad. Den har stor potential eftersom den tillåter studiet av genen leverans till intakt mänsklig vävnad, analys av genen leverans till en mängd mänsklig vävnad, inklusive maligna vävnad och kan ge viktig information om effekterna av den höga grad av variabilitet mellan enskilda patienter med respekt att genen upptag. Olika cancertyper kan ha varierande påverkan på effekten av de olika stadierna av framgångsrika transgenen uttryck i celler, där DNA-upptag och efterföljande transkription och översättning. Dessa steg beskrivs i videon animering med virala vektorer som exempel. Den självlysande system för upptäckt visar snabb och exakt kvantifiering av genuttryck inom enskilda skivor utan att behöva vävnaden offer. För replikering inkompetent vektorer, som används i denna studie är luminiscens direkt relaterad till genuttryck av celler.
Denna modell system kommer att ge värdefull information om genen leverans till patientens vävnad före inträde klinisk prövning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Detta arbete har finansierats genom Cork South Infirmary Victoria Universitetssjukhuset bröstcancer fond, den irländska Cancer Society (CRI07TAN) och Cork Cancer Research Centre. Replikering inkompetenta rekombinant Adenovirus 5 partiklar under transkriptionella kontroll av CMV promotor var en slags gåva från professor Andrew Baker, University of Glasgow.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6429 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Firefly Luciferin | Biosynth International, Inc | ||
| Dermabond | Johnson & Johnson | ||
| Vibrotome | Leica Microsystems | VT 1000 A |
References
- van de Bovenkamp, M., Groothuis, G. M., Draaisma, A. L., Merema, M. T., Bezuijen, J. I., van Gils, M. J. Precision-cut liver slices as a new model to study toxicity-induced hepatic stellate cell activation in a physiologic milieu. Toxicol Sci. 85, 632-638 (2005).
- Speirs, V., Green, A. R., Walton, D. S., Kerin, M. J., Fox, J. N., Carleton, P. J. Short-term primary culture of epithelial cells derived from human breast tumours. Br J Cancer. 78, 1421-1429 (1998).
- Kirby, T. O., Rivera, A., Rein, D., Wang, M., Ulasov, I., Breidenbach, M. A novel ex vivo model system for evaluation of conditionally replicative adenoviruses therapeutic efficacy and toxicity. Clin Cancer Res. 10, 8697-8703 (2004).
- Josserand, V., Texier-Nogues, I., Huber, P., Favrot, M. C., Coll, J. L. Non-invasive in vivo optical imaging of the lacZ and luc gene expression in mice. Gene Ther. 14, 1587-1593 (2007).
