Summary
Dit artikel beschrijft de cultuur van de patiënt weefsel plakjes voor genafgifte studies en daaropvolgende analyse van genexpressie met behulp van IVIS bioluminescentie beeldvorming.
Abstract
Deze video beschrijft het gebruik van weefsel patiënt als een ex vivo model voor de studie van gen levering. Verse patiënt weefsel verkregen op het moment van de operatie is gesneden en onderhouden in cultuur. Het ex-vivo model systeem maakt het mogelijk voor de fysieke levering van genen in intact weefsel patiënt en gen-expressie wordt geanalyseerd door bioluminescentie beeldvorming met behulp van de IVIS detectiesysteem. Het bioluminescente detectiesysteem demonstreert snelle en accurate kwantificering van genexpressie binnen de afzonderlijke segmenten, zonder de noodzaak voor weefsel te offeren. Dit slice weefselkweek systeem kan worden gebruikt in een verscheidenheid van weefsel vormen, met inbegrip normaal en kwaadaardig weefsel en laat ons toe om de effecten van de heterogene aard van intact weefsel en de hoge mate van variabiliteit tussen individuele patiënten. Dit model systeem kan gebruikt worden in bepaalde situaties als een alternatief voor dierlijke modellen en als aanvullende preklinische mode voor het binnengaan klinisch onderzoek.
Protocol
Voorbereiding van de Media en reagentia
- Antibiotica-oplossing
Fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) met 200 U / ml penicilline, 200 ug / ml streptomycine, 5 ng / ml fungizone - Inzameling en verwerking medium
Dulbecco's gemodificeerd Eagle medium (DMEM) met 200 U / ml penicilline, 200 ug / ml streptomycine, 5 ng / ml fungizone - Kweekmedium
Collectie medium dat 10% hitte-geïnactiveerd foetaal runderserum
I. Tissue verzameling en opslag
Goedkeuring voor de patiënt weefsel collectie is verkregen uit de Clinical Research Ethics Committee van de Cork Teaching Hospitals en geïnformeerde toestemming werd verkregen van de patiënten de dag voor de operatie. Leverweefsel werd verkregen van patiënten die een partiële hepatectomie voor kwaadaardige ziekte.
- Verse patiënt weefsel wordt verkregen op het moment van chirurgische resectie.
- Weefsel wordt opgeslagen in de collectie van media bij 4 ° C (weefsel kan worden gekoeld bewaard tot 12 uur zonder een significant verlies van levensvatbaarheid, maar onmiddellijke behandeling wordt aanbevolen).
II. Tissue slice voorbereiding en cultuur
Slicing werd uitgevoerd met behulp van een vibratome (Leica, Duitsland). Het weefsel snijden systeem werd gebruikt volgens de instructies van de fabrikant. Tissue slice preparaat werd uitgevoerd onder een steriele kap met behulp van instrumenten schoongemaakt met 70% 2-propanol. Plakdikte is vastgesteld op 2,000 micron en sneed met behulp van een heen-en mes op 22-26 rpm.
- Weefsel wordt gewassen in antibiotica-oplossing drie keer.
- Weefsel is bevestigd aan montage stadium met behulp van niet-giftige lijm (Dermabond).
- Slice dikte is ingesteld en snijden wordt bereikt bij 22-26 rpm.
- Slices worden onderhouden in kweekmedium in 6-well cultuur gerechten (een slice per well) bij 37 ° C met 5% CO 2 in een vochtige omgeving.
III. Gene levering aan tissue slices
- Slices zijn vooraf geïncubeerd bij 37 ° C gedurende 2 uur voorafgaand aan de behandeling.
- Kweekmedium wordt vervangen door de behandeling medium.
- Slices worden rechtstreeks geïnjecteerd met virale vector (25 ul van virale deeltjes Ad5.CMVluc [1x10 9]). Als alternatief, kunnen deeltjes worden toegevoegd aan het medium, voor passieve infusie.
- Na twee uur incubatie, wordt toegevoegd aan serum medium.
IV. Analyse van genexpressie door lichtgevende analyse
- Slices zijn geïnjecteerd met 100 pi van luciferine substraat (3 mg / ml).
- 6-well cultuur schotel is geplaatst op het podium en geïncubeerd gedurende 10 minuten.
- Schijfjes worden afgebeeld gedurende 5 min bij een hoge gevoeligheid (Figuur 1).
V. representatieve resultaten
Figuur 1. Bioluminescent beeldvorming van de patiënt lever plakken met behulp van IVIS detectiesysteem.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Beschrijven we een ex vivo patiënt weefselkweek werkwijze en bioluminescente detectie systeem voor de beoordeling van gen levering binnen niet-vaste menselijk weefsel. De methode biedt een eenvoudige en reproduceerbare manier van het kweken van weefsel plakjes. Het heeft een aanzienlijk potentieel omdat hiermee de studie van gen in menselijk weefsel intact, de analyse van gen delivery in een verscheidenheid van menselijk weefsel waaronder kwaadaardig weefsel en kan belangrijke informatie verschaffen over de effecten van de hoge mate van variabiliteit tussen individuele patiënten met respect tot gen opname. Verschillende vormen van kanker kan hebben verschillende invloeden op de effectiviteit van de verschillende stadia van succesvolle transgen-expressie in cellen, waarbij DNA-opname en de daarop volgende transcriptie en vertaling. Deze stappen worden beschreven in de video-animatie, met behulp van virale vector als een voorbeeld. Het bioluminescente detectiesysteem demonstreert snelle en accurate kwantificering van genexpressie binnen de afzonderlijke segmenten, zonder de noodzaak voor weefsel te offeren. Voor replicatie incompetent vectoren, zoals toegepast in deze studie, luminescentie is direct gerelateerd aan genexpressie door cellen.
Dit model systeem zal waardevolle informatie over de gen-levering aan de patiënt weefsel vóór het invoeren van klinisch onderzoek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit werk werd gefinancierd door de Cork South Ziekenhuis Victoria University Hospital Borst fonds, de Ierse Cancer Society (CRI07TAN) en de Cork Cancer Research Centre. Replicatie incompetente recombinant adenovirus 5 deeltjes onder de transcriptionele controle van de CMV promoter was een soort geschenk van prof. dr. Andrew Baker, Universiteit van Glasgow.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6429 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Firefly Luciferin | Biosynth International, Inc | ||
| Dermabond | Johnson & Johnson | ||
| Vibrotome | Leica Microsystems | VT 1000 A |
References
- van de Bovenkamp, M., Groothuis, G. M., Draaisma, A. L., Merema, M. T., Bezuijen, J. I., van Gils, M. J. Precision-cut liver slices as a new model to study toxicity-induced hepatic stellate cell activation in a physiologic milieu. Toxicol Sci. 85, 632-638 (2005).
- Speirs, V., Green, A. R., Walton, D. S., Kerin, M. J., Fox, J. N., Carleton, P. J. Short-term primary culture of epithelial cells derived from human breast tumours. Br J Cancer. 78, 1421-1429 (1998).
- Kirby, T. O., Rivera, A., Rein, D., Wang, M., Ulasov, I., Breidenbach, M. A novel ex vivo model system for evaluation of conditionally replicative adenoviruses therapeutic efficacy and toxicity. Clin Cancer Res. 10, 8697-8703 (2004).
- Josserand, V., Texier-Nogues, I., Huber, P., Favrot, M. C., Coll, J. L. Non-invasive in vivo optical imaging of the lacZ and luc gene expression in mice. Gene Ther. 14, 1587-1593 (2007).
