Summary
Bu makale, gen teslimat çalışmaları ve IVIS biyoparlaklık görüntüleme kullanarak gen ekspresyonu sonraki analiz için hasta doku dilim kültür açıklar.
Abstract
Bu video ex vivo gen teslim çalışması için bir model olarak hasta doku kullanımı anlatılmaktadır. Taze hasta doku cerrahi sırasında elde dilimlenmiş ve kültür tutulur. Ex vivo model sistem sağlam hasta doku ve gen ekspresyonu biyoparlaklık görüntüleme IVIS algılama sistemi kullanılarak analiz genlerin fiziksel teslimat için sağlar. Bioluminescent algılama sistemi doku kurban için ihtiyaç olmadan hızlı ve doğru tek tek dilimler içinde gen ekspresyonu kantifikasyon göstermektedir. Bu dilim doku kültürü sistemi normal ve malign doku da dahil olmak üzere çeşitli doku tiplerinin kullanılan ve bize sağlam doku heterojen doğası ve yüksek derecede bireysel hastalar arasında değişkenlik etkilerini incelemek sağlar. Bu model sistemi ve klinik araştırmaya girmeden önce bir tamamlayıcı preklinik modu olarak hayvan modellerinde bir alternatif olarak bazı durumlarda kullanılabilir.
Protocol
Medya ve Reaktifler hazırlanması
- Antibiyotik Çözüm
Fosfat tamponlu salin (PBS) 200 U / ml penisilin, 200 mcg / ml streptomisin, 5 mg / ml fungizone - Toplama ve Arıtma orta
Dulbecco'nun 200 U / ml penisilin modifiye kartal orta (DMEM), 200 mg / ml streptomisin, 5 mg / ml fungizone - Kültür ortamı
Koleksiyon orta% 10 ısı ile inaktive edilmiş fetal sığır serumu içeren
I. Doku toplama ve depolama
Hasta doku toplanması için Onay Klinik Araştırmalar Etik Kurulu Cork Hastaneler Öğretim elde edildi ve hastalar operasyondan bir gün önce bilgilendirilmiş onam alınmıştır. Malign hastalık için kısmi hepatektomi uygulanan hastalarda karaciğer dokusu elde edildi.
- Taze hasta doku cerrahi rezeksiyon zaman elde edilir.
- Doku toplama medya saklanan 4 ° C (Doku canlılığı kaybı olmadan 12 saat kadar buzdolabında saklanabilir, ancak hemen işleme tavsiye edilir).
II. Doku dilim hazırlanması ve kültür
Dilimleme bir vibratome (Leica, Almanya) kullanılarak yapıldı. Üreticinin talimatlarına göre doku dilimleme sistemi kullanılmıştır. Doku dilim hazırlanması% 70 2-propanol ile temizlenmelidir aletler kullanılarak steril bir başlık altında yapıldı. Dilim kalınlığı 2000 mikron ve pistonlu 22-26 rpm'de bıçak kullanılarak kesilir.
- Doku antibiyotik solüsyon içinde üç defa yıkanır.
- Doku, toksik olmayan yapıştırıcı (Dermabond) kullanarak montaj aşamasında eklenir.
- Dilim kalınlığı ayarlanır ve dilimleme 22-26 dak elde edilir.
- Dilimler 37 6 kuyu kültür yemekleri (her bir dilim) kültür ortamında muhafaza ° C,% 5 CO 2 nemlendirilmiş bir ortam.
III. Gen teslim doku dilimleri
- Dilimler ° C 2 saat önce 37 tedavi öncesi inkübe edilir.
- Kültür orta tedavi orta ile değiştirilir.
- Dilimler, viral vektör (viral parçacıkların 25 ul Ad5.CMVluc [1x10 9]). Doğrudan enjekte edilir Alternatif olarak, pasif infüzyon için parçacıklar, orta eklendi olabilir.
- Inkübasyon iki saat sonra, serum orta eklenir.
IV. Bioluminescent analizi ile gen ekspresyon analizi
- Dilimler 100 ul luciferase substrat (3 mg / ml) enjekte edilir.
- 6-sıra kültür kaplarına yerleştirilir ve sahnede 10 dakika inkübe edilir.
- Dilimler, yüksek hassasiyeti (Şekil 1) 5 dakika görüntülü.
V. Temsilcisi Sonuçlar
Şekil 1 IVIS algılama sistemi kullanarak hastanın karaciğer dilim Bioluminescent görüntüleme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Biz ex vivo olarak hasta doku kültürü yöntemi ve insan doku içinde sabit olmayan gen teslim değerlendirilmesi için bioluminescent algılama sistemi açıklanmaktadır. Bu yöntem basit ve tekrarlanabilir bir kültür dokusu dilim bir şekilde sunmaktadır. Malign doku da dahil olmak üzere çeşitli insan doku içine bozulmamış insan dokusu içine gen teslim çalışmada, gen teslim analizini sağlar ve saygı ile bireysel hastalar arasında değişkenlik derecesi yüksek olan etkileri ile ilgili önemli bilgi vermek gibi önemli bir potansiyele sahiptir gen alımı. Farklı kanser türleri, DNA alımı ve sonraki transkripsiyon ve çeviri içeren hücreler başarılı transgen ekspresyonu farklı aşamalarında etkinliğini etkiler değişik olabilir. Bu adımlar, bir örnek olarak viral vektör kullanılarak, video animasyon açıklanmıştır. Bioluminescent algılama sistemi doku kurban için ihtiyaç olmadan hızlı ve doğru tek tek dilimler içinde gen ekspresyonu kantifikasyon göstermektedir. Bu çalışmada istihdam gibi beceriksiz vektörlerin, çoğaltma, lüminesans hücreleri tarafından gen ekspresyonu ile doğrudan ilişkili.
Bu model sistemi giren klinik çalışma öncesinde hasta doku geni teslimi ile ilgili değerli bilgiler sağlayacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu çalışma, Cork Güney Revir Victoria Üniversitesi Hastanesi Göğüs fonu, İrlanda Kanser Derneği (CRI07TAN) ve Cork Kanser Araştırma Merkezi ile finanse edildi. CMV organizatörü transkripsiyonel kontrol altında çoğaltma beceriksiz rekombinant Adenovirüs 5 parçacıklar Glasgow Üniversitesi Prof. Andrew Baker, bir tür hediye edildi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6429 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Firefly Luciferin | Biosynth International, Inc | ||
| Dermabond | Johnson & Johnson | ||
| Vibrotome | Leica Microsystems | VT 1000 A |
References
- van de Bovenkamp, M., Groothuis, G. M., Draaisma, A. L., Merema, M. T., Bezuijen, J. I., van Gils, M. J. Precision-cut liver slices as a new model to study toxicity-induced hepatic stellate cell activation in a physiologic milieu. Toxicol Sci. 85, 632-638 (2005).
- Speirs, V., Green, A. R., Walton, D. S., Kerin, M. J., Fox, J. N., Carleton, P. J. Short-term primary culture of epithelial cells derived from human breast tumours. Br J Cancer. 78, 1421-1429 (1998).
- Kirby, T. O., Rivera, A., Rein, D., Wang, M., Ulasov, I., Breidenbach, M. A novel ex vivo model system for evaluation of conditionally replicative adenoviruses therapeutic efficacy and toxicity. Clin Cancer Res. 10, 8697-8703 (2004).
- Josserand, V., Texier-Nogues, I., Huber, P., Favrot, M. C., Coll, J. L. Non-invasive in vivo optical imaging of the lacZ and luc gene expression in mice. Gene Ther. 14, 1587-1593 (2007).
