Summary
여기, 우리는 효율적인 cryopreservation을위한 방법을 설명하고 매우 풍부한 문화의 연결을 생성하는 대뇌 피질의 뇌 조직 블록의 해동. 이 간단한 프로토콜은의 연결을 astrocyte와의 연결을 전구체 세포 배양 이후 세대 유연성을 제공합니다.
Abstract
본 연구에서는, 우리는 성공적으로 cryopreservation과 매우 풍부한 문화의 연결을 생성하는 대뇌 피질의 뇌 조직 블록의 해동을위한 표준 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜에 사용되는 냉동 매체는 행크의 버퍼 소금 솔루션 (HBSS)에 희석 10% 디메틸 sulfoxide (DMSO)입니다. 대뇌 피질의 조직 단위는 냉동 매체를 포함하는 cryovials로 전송 천천히 -1 속도 제어 냉동 컨테이너 ° C / 분 냉동 있습니다. 포스트 해동 처리와 지속적으로 10 일 이내에 문화의 연결 네트워크의 중요한 확장에 처음 5 일 동안 급속한 성장을 neuritic 전시의 연결 - 풍부한 문화를 생산 냉동 조직 블록의 해리. astrocytic 마커 glial fibrillary 산성 단백질 (GFAP)과의 연결 마커 베타 tubulin 클래스 III와 Immunocytochemical 얼룩은 문화의 뉴런과 astrocytes 높은 숫자를 공개했다. 조직 블록 분리 후 신경 전구체 세포 문화의 생성은 급속도로 차별 조건 뉴런과 astrocytes 다수의 생산 neurospheres을 확장 결과. 이 간단한 cryopreservation 프로토콜은의 연결을 astrocyte와의 연결을 전구체 세포 배양 이후 세대 증가 유연성을 부여 피질 뇌 조직 블록의 급속한, 효율적인, 그리고 저렴한 보존에 대한 수 있습니다.
Protocol
1. 두피 조직 블록의 Cryopreservation
재료 준비
- 멸균 물 (1시 9분)에서 10X 재고 솔루션에서 diluting에 의해 1X 행크의 버퍼 소금 솔루션 (HBSS)을 준비합니다. 4oC에 저장 HBSS.
- HBSS (1시 9분)에 DMSO를 diluting 10 % DMSO 냉동 매체를 준비합니다. 냉장 냉동 때까지 매체 cryopreservation 전에 신선했고 4oC에 저장해야합니다.
- 강철 면도날은 조직의 체계적인 돼지에 사용됩니다. 사용하기 전에 면도날이 2 시간을위한 70 %의 에탄올에 잠수하여 소독을합니다. 즉시 조직 처리하기 전에 멸균 물 3 회와 면도날을 씻어. 그것이 산화하는 경향이므로, 시간의 과도한 금액에 대한 멸균 물의 면도칼을 떠나 피하십시오.
- Nalgene 냉동 컨테이너는 cryovials (2.5 ML)를로드하고 살균 생물 학적 캐비닛으로 가지고있다. 냉장 냉동 중간 1 ML 각 유리병에 추가됩니다. 냉동 컨테이너는 다음 적어도 2 시간에 대한 4oC에 배치됩니다.
, 청소 초핑 및 냉동
- 냉동으로 뇌 조직은 meningeal 막과 혈관의 청소입니다. 얼음 팩 상단에서 작업하는 동안주의 깊게 조직에서 파편을 제거하는 살균 바늘 도움말을 사용하십시오. 청소 조직은 차가운 HBSS로 가볍게 씻어서 자르고을위한 새로운 배양 접시로 전송해야합니다.
- 얼음 팩 위에 작업, 빠른 속도로 약 1mm 3 개의 블록으로 조직을 잘라하는 소독 면도날을 사용합니다. 더 균일한 블록 크기의 결과, 자르고 절차보다 나은 제어에 시간 결과를 청소 조직의 작은 부분 작업.
- 천천히 50 ML 원뿔 튜브 HBSS 50 ML에 다진 조직을 추가합니다. 부드럽게 남아있는 조직 블록을 수집하기 위해 HBSS와 페트리 접시를 씻어. 조직 블록이 느슨하게 포장 조직 블록 펠렛을 만들고, 튜브의 바닥에 내려 수 있습니다.
- 조직이 정착되는 동안, 생물 안전 캐비닛에 이전에 차게 냉동 컨테이너와 cryovials 가져. 조직을 추가하는 과정을 촉진하는 모든 cryovials을 모자를 벗다.
- 모든 조직 블록 정착 후, 부드럽게 펠렛 위의 미디어의 매우 얇은 레이어를 떠나, 초과 HBSS를 대기음. 그것은 조직 블록이 서로 준수 원인이되므로 원심 분리는 크게 냉동 효율이 떨어지면서, 낙담합니다.
- 천천히 넓은 orifices (멸균 가위로 끝부분을 절단)에 피펫 팁을 사용하여 느슨한 조직 블록 펠렛의 맨 아래에 200 μL를 수집합니다. 한 cryovial로 자료를 전송하고 펠렛의 맨 아래에서 다음 다시 수집 조직에 이동합니다. 이것은 전체 조직 할당 절차 냉동 컨테이너 당 3-4 분 이상하지 않는 것이 중요합니다. 이것은 조직이 동결되기 전에 시간은 짧은 기간 동안 DMSO에 노출되는 보장합니다. 유리병에 조직을 전송 후, 최소 4 시간을위한 A - 80oC 냉동실에 냉동 컨테이너를 놓습니다. 또는 냉동 컨테이너는 -80 OC에서 하룻밤 남아있을 수 있습니다. 남아있는 냉동 컨테이너에 대해이 과정을 반복합니다.
- 냉동 컨테이너 (S)에서 장기 저장을위한 액체 질소 탱크에 cryobox과 장소에 cryovials를 전송합니다.
2. 해동 및 냉동 두피 조직 블록의 Culturing
재료 준비
- 하루 전에 해동 조직 샘플을, 폴리 - L - 라이신 코팅 배양 접시 / coverslips 준비가되어 있습니다. 일반적으로 대뇌 피질의 뉴런에 우리는 500 μg / ML 또는 1mg / ML로 코팅 요리를 준비합니다. 완전히 접시의 바닥을 감추기에 충분 할만큼 폴리 - L - 라이신 솔루션을 (borate 버퍼에서 만든)을 추가합니다. 유리 coverslips이 필요한 경우, 그들은 완전히 폴리 - L - 라이신 솔루션에 가라앉아 있는지 확인합니다. 최소한 12 시간을위한 부화. 사용하기 전에 철저한 멸균 물의 자유로운 양의 3 배, 5 분 각 요리를 씻어.
- 따뜻한 HBSS은 해동 조직뿐만 아니라 세포 suspensions로 조직을 떼어 놓다을 청소하는 데 사용됩니다. 필요한 HBSS의 볼륨 해동하는 조직의 양에 따라 달라질 수 있지만, 일반적으로 1 cryovial은 HBSS의 50 ML에 희석하고 HBSS 10 ML에 dissociated 것입니다.
- Dulbecco의 수정된 이글 매체와 10% 철분 보충 소 송아지 혈청 (EBS)를, 1 % antimycotic / 항생제 (AA) 혼합 (DMEM (++))가 37 ° C 물 목욕에 배치해야합니다.
- 도금 매체 (NB (+++))는 사용하기 전에 신선한하여야한다. 이 매체는 1퍼센트 항생제 / antimycotic 플러스 B27와 N2의 보충을 추가하여 준비가되어 있습니다.
참고 : 십자가 (+)로 추가 미디어 이름은 미디어의 기본 조성에 첨가제의 포함을 나타냅니다. 이 문서에서는 DMEM (+ +) 나타냅니다 DMEM 플러스 10% EBS 플러스 1퍼센트 AA, 반면 NB (+++) 상징 NB PL우리 1퍼센트 AA 플러스 B27 플러스 N2.
해동 및 Culturing
- 액체 질소 탱크에서 cryovials를 제거하고 급속 해동 37 °에만 작은 얼음 펠렛 때까지 물을 욕조에 C는 유리 내부에 관찰 내용입니다.
- 부드럽게 원뿔 관에 따뜻한 HBSS의 50mL에 병을 콘텐츠를 전송할 수 있습니다. 부드럽게 cryovial 항아리에 남아있는 조직 블록을 이동시키다하는 넓은 구멍 팁을 사용합니다. 관에게 3-4 회를 반전하고 조직이 서서히 바닥에 수집 수 있습니다. 조직 빠르게 정착해야하지만 블록이 너무 작은 경우에는이 권장됩니다 원심 분리 (~ 200 X g)를 발생 가벼운하지 않을 수 있습니다.
- 초과 HBSS를 대기음.
- 조직 펠렛 및 0.25 %의 트립신과 DNAase 50 μL 300 μL에 따뜻한 HBSS 10 ML을 추가합니다. 궤도 통에 다음 5 분, 장소에 대해 37 ° C 물 욕조에 품어는 ° C 추가 5 분 80 RPM 37로 설정합니다.
- 이 기간 이후, 생물 안전 캐비닛에 조직 블록을 가지고 있으며 흐린 세포 현탁액을 형성 때까지 신중하게 조직 블록을 선동하기 위해 10 ML의 피펫을 사용합니다. 따뜻한 DMEM 10 ML을 추가하여 트립신을 비활성화 (+ +) 세포 현탁액 수 있습니다.
- 5 분 1,200 X g에서 dissociated 세포를 원심 분리기. 뜨는을 기음과 폐기, 따뜻한 DMEM 10 ML에있는 세포 펠렛을 resuspend (+ +)과 hemocytometer를 사용하여 휴대폰 번호를 계량.
- 폴리 - L - 라이신 코팅 접시 플레이트 세포. 일반적으로 60 mm 요리가 1x10 6 전지와 도금 것입니다.
- 세포 조직 문화 인큐베이터에서 약 1 시간을위한 요리 / coverslips에 연결할 수 있습니다. 그것은 효과적인 첨부 파일이 관찰 때까지 한 판의 모든 10 분 첨부 파일의 진행 상황을 모니터링하는 것이 좋습니다. 그런 다음, 부드럽게 신선한 DMEM (++).으로 미디어를 대체
- 24 시간 후, DMEM를 교체 (+ +) 따뜻한 NB (+++).과 중간 부분의 변화 (50 %)는 신선한 NB (+++).있는 모든 오일 수행됩니다 건강한 문화는 일반적으로 24 시간 후에 분화와 프로세스의 성장의 흔적을 보여줍니다. 이러한 조건에서 모든 4-5일 일부 매체 변경을 수행, 문화가 최대 4-6주 시간의 연장 기간 동안 유지하실 수 있습니다.
- 의 연결을 전구체 세포 (NPCs)의 생성을 위해, 유사한 프로토콜은 원심 분리 후, EBS없는 DMEM 사용되는 예외와 함께 사용됩니다. 세포 neuropheres 형성을 허용하는 B27과 EGF (20 NG / ML)로 보충 DMEM/F12 (1시 3분)에 T - 25 flasks에 도금입니다. NPCs을 차별화하는 데, neurospheres는 laminin (10 UG / ML) DMEM/F12 (1시 3분) N2와 보충 매체 코팅 coverslips에 도금입니다.
3. 대표 결과
건강한 문화 오일 이후의 해동 후 크게 성장과 분화를 표시하고 보통 10 일 (그림 1)에 의해 성장에 안정합니다. 이러한 문화의 Immuncocytochemical 얼룩은 수많은 astrocytes (그림 2A)를 공개하고 인간과 쥐의 모두 기본의 연결을 문화 뉴런 (그림 2B). 이 프로토콜은 또한 자유 부동 neurospheres (그림 3A), 차별 조건, 고품질의 혼합 문화 (그림 3B, C)의 결과에 따라.로서 NPCs의 생성에 적합합니다
그림 1. 냉동 인간의 대뇌 피질 조직의 세포 문화. 냉동 인간의 대뇌 피질 조직 블록 해동 및 도금 폴리 - 리신 코팅 coverslips과 10 일간 재배하고 있습니다. 으로 5 일째 셀 확장은 분명하고 일 10 confluency이 이루어진다. 스케일 바 : 100 μm의.
그림 2. 셀 문화 Immunocytochemical 얼룩이. (A) 문화가 glial 마커 glial fibrillary 산성 단백질 (GFAP, 굵은 화살표)와 스테인드되었습니다. (B) 뉴런은의 연결 마커 베타 tubulin III (시까지, 얇은 화살표)를 발견했다. (C) 인간과 쥐의 문화 두 문화에서 10 일 후에 풍부한 glia과 뉴런을 보여줍니다. 차 항체 : 마우스 방지 GFAP (1:1000)와 토끼 안티 때까지 (1:1000). 차 항체 : 안티 - 마우스 알렉사 594 (1:500)와 안티 - 토끼 알렉사 488 (1:500). 핵의 얼룩 : Hoestch 파란색 (1:1000). 스케일 바 : 50 μm의.
그림 3. neurospheres의 생성. (A) 냉동 조직 위에서 설명한 및 neurospheres로 전파할 수로 처리되었습니다. (B) Neurospheres가 떨어진 neurosphere에서 마이 그 레이션하는 세포의 결과, 차별 조건 하에서 유리 coverslips에 도금 및 10 일 동안 성장했다. (C) 뉴런과 astrocytes 모두 차별 neurosphere의 확장 주변에 존재한다. 원자력 counterstaining, 그림 2에서와 같이 사용되는 기본 및 보조 항체.
Discussion
Cryopreservation는 나중에 사용하기 위해 은행 소중한 뇌 조직 샘플 수있는 기회를 제공하고 있습니다. 우리가 신경 세포 - 풍부한 문화와 냉동 뇌 조직의 연결 블록에서 전구체 세포 모두를 생성하는 간단하지만 효과적인 프로토콜을 설명합니다. 이것은 경제적인 절차는 더 비싼 요금 제어 냉동고를 활용하여 전통적인 cryopreservation 기술의 비용을 방지합니다. 프로토콜은 조직 블록을 동결하는 빠른 아직 효과적인 수단을 제공함으로써 해동 후 가능한의 연결을 문화의 생성을 허용합니다. 전체 냉동 과정은 약간 20 분 정도 걸릴 수 있습니다. 기본의 연결을 문화뿐만 아니라,이 방법을 조직 블록을 사용하는 것은 또한 부유 neurospheres로 성장 NPCs를 생성하기 위해 해동 수 있습니다. 이 점에서 우리 동결 매체 혈청의 부족은 세포가 undifferentiated 상태로 유지되는지 확인합니다. 차별 조건에서 neurospheres는 냉동 조직 쇼 확장과 새로운 조직에서 생성된 neurospheres 매우 비교 차별화 속도에서 생산.
Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 연구는 UCI (AR 및 SP)에서 학부 연구 기회 프로그램에서 보조금 캘리포니아 알츠하이머 질병 이니셔티브없이 건강 부여의 국립 연구소의 국가에서 보조금에 의해 지원되었다. HD38466, 그리고 알츠하이머 병 연구 센터는 부여하지 않습니다. AG16573 (JB)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Invitrogen | 11995-073 | High gluclose 1X |
| Bovine calf serum supplemented | Hyclone | SH30072.03 | For culture medium |
| Neurobasal-A Medium (1X), liquid | Invitrogen | 1088-022 | |
| B27 Supplement | Invitrogen | 17504-044 | Supplement for Neurobasal medium |
| N2 Supplement | Invitrogen | 17502-048 | Supplement for Neurobasal medium |
| Trypsin (10X) | Cellgro | 25-054CI | Tissue dissociation |
| Deoxyribonuclease 1 from bovine pancreas (DNase) | Sigma-Aldrich | D4527-30KU | Tissue dissociation |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) (10X) | GIBCO, by Life Technologies | 14065 | Cleaning tissue, washes, and freezing medium |
| Poly-L-Lysine- 500mg | Invitrogen | P2636 | Substrate for adhesion of neuronal cells |
| antibiotic-antimycotic (100X), liquid | Invitrogen | 15240-062 | To prevent contamination |
| Large orifice pipette Tips (1-200 ul) | Fisher Scientific | 02-681-141 | To prevent shear stress to cells |
| Graduated pipette tips (101-1000 ul) | USA Scientific, Inc. | 1111-2721 | |
| 21 G1 precision guide needles | BD Biosciences | 305165 | To clean tissue |
| 10 ml pipette | USA Scientific, Inc. | 1071-0810 | Individually wrapped |
| 50 ml tubes | USA Scientific, Inc. | 926-9-04 | |
| Single edge razor blade | Smith & Nephew Inc. | 67-0238 | To chop tissue |
| 60 x 15 mm polystyrene petri dish | USA Scientific, Inc. | 8609-0160 | For general culture |
| 100 x 15 mm polystyrene petri dish | USA Scientific, Inc. | 8609-0010 | For cleaning tissue |
| Cryogenic box | Nalge Nunc international | 5026-1010 | |
| Freezing container | Nalge Nunc international | 5100-0001 | "Mr. Frosty" |
| 2.0 ml cryogenic vials | Nalge Nunc international | 5012-0020 | |
| DMSO | Fisher Scientific | D128-500 | For freezing medium |
| Ethanol 200 proof | Sigma-Aldrich | E7023 | For sterilizing razor blade |
References
- Robbins, R. J. Cryopreservation of human brain tissue. Exp Neurol. 107, 208-213 (1990).
- Ware, C. B., Nelson, A. M., Blau, C. A. Controlled-rate freezing of human ES cells. Biotechniques. 38, 879-880 (2005).
- Paynter, S. J. Principles and practical issues for cryopreservation of nerve cells. Brain Res Bull. 75, 1-14 (2008).
- Thirumala, S., Gimble, J. M., Devireddy, R. V. Cryopreservation of stromal vascular fraction of adipose tissue in a serum-free freezing medium. J Tissue Eng Regen Med. 4, 224-232 (2010).
