Summary
Aqui, nós descrevemos um método eficiente para criopreservação e descongelamento de blocos de tecido cortical do cérebro para gerar altamente enriquecido culturas neuronal. Este protocolo simples, fornece flexibilidade para a geração posterior de culturas de células neuronais, astrócitos, e neuronal precursor.
Abstract
Neste estudo, descrevemos um protocolo padronizado para a criopreservação e descongelamento de blocos de tecido cortical do cérebro para gerar altamente enriquecido culturas neuronal. Para este protocolo o meio de congelamento utilizado é de 10% dimetil sulfóxido (DMSO) diluído em solução de Hank Sal Buffered (HBSS). Blocos de tecido cortical são transferidos para criotubos contendo o meio de congelamento e, lentamente, congelados a -1 ° C / min em um recipiente taxa controlada de congelamento. Pós-descongelamento de processamento e dissociação de blocos de tecido congelado consistentemente produzidos neuronal enriquecido culturas que apresentaram crescimento rápido durante neuríticas os primeiros 5 dias em cultura e expansão significativa da rede neuronal em 10 dias. Coloração imunocitoquímica com o marcador glial fibrilar astrocíticos proteína ácida (GFAP) e do marcador neuronal beta-tubulina classe III, revelou um alto número de neurônios e astrócitos em culturas. Geração de culturas de células precursoras neurais após a dissociação do tecido bloco resultou em rápida expansão neurospheres, que produziu um grande número de neurônios e astrócitos em condições de diferenciação. Este protocolo de criopreservação simples permite a preservação rápido, eficiente e barata de blocos de tecido cortical do cérebro, que concede uma maior flexibilidade para a geração posterior de culturas de células neuronais, astrócitos, e neuronal precursor.
Protocol
1. Criopreservação de tecido cortical Blocos
Preparação de material
- Preparar a solução de 1X Hank Sal Buffered (HBSS), diluindo a solução estoque 10X em água estéril (1:9). HBSS armazenar a 4oC.
- Prepare meio de congelamento de 10% DMSO por diluição de DMSO em HBSS (1:9). O meio de congelamento deve ser feita antes da criopreservação fresco e armazenado a 4oC até refrigerados.
- Uma lâmina de barbear de aço é usada para o corte sistemático de tecido. Antes do uso, a lâmina de barbear é esterilizado por submersão em etanol 70% para 2 hr. Imediatamente antes da transformação do tecido, lavar a lâmina com água estéril 3 vezes. Evite deixar a lâmina em água estéril para uma quantidade excessiva de tempo, como é propensa à oxidação.
- Um recipiente de congelamento Nalgene é carregado com criotubos (2,5 mL) e depois levados a um gabinete estéril biológica. 1 mL de meio de congelamento refrigerados é adicionado a cada frasco. O recipiente de congelamento é então colocada a 4oC por pelo menos 2 horas.
Limpeza, Chopping, e Congelamento
- O tecido cerebral para ser congelado é limpo da membrana meníngea e vasos sanguíneos. Use dicas agulha estéril para remover cuidadosamente os restos de tecido, enquanto trabalhava em cima de um bloco de gelo. Tecido limpas devem ser lavadas levemente com HBSS frio e transferidos para uma placa de Petri nova para cortar.
- Trabalhando em cima de um bloco de gelo, use uma lâmina de barbear esterilizados para rapidamente cortar o tecido em aproximadamente 1 mm a 3 quadras. Trabalhar com pequenas porções de tecido limpo em um tempo resulta em um melhor controle sobre o processo de corte, resultando em tamanhos de bloco mais uniforme.
- Lentamente, adicionar o tecido cortado em 50 mL de HBSS em um tubo cônico de 50 mL. Lave o prato de Petri com HBSS a fim de recolher todos os blocos tecido remanescente. Permitir que os blocos de tecido para descer ao fundo do tubo, criando um tecido ligeiramente comprimido bloco pellet.
- Enquanto o tecido está se instalando, trazer o recipiente previamente refrigerados congelamento e criotubos para o gabinete de segurança biológica. Destape todos os criotubos para apressar o processo de adição de tecido.
- Depois de todos os blocos de tecido se instalaram, aspirar cuidadosamente a HBSS excesso, deixando uma camada muito fina de mídia acima da pelota. Centrifugação é desencorajado, pois ele fará com que os blocos de tecido para aderir uns aos outros, diminuindo significativamente a eficiência de congelamento.
- Lentamente coletar 200 mL do fundo do bloco de tecido solto pellet usando ponteira com orifícios de largura (cortar a ponta com uma tesoura esterilizada). Transferir o material para um cryovial e passar para o tecido, ao lado de novo recolher do fundo do sedimento. É essencial que o procedimento de atribuição de todo o tecido não leva mais do que 3-4 min por recipiente de congelamento. Isso garante que o tecido é exposto a DMSO por apenas um curto período de tempo antes do congelamento. Depois de transferir o tecido para os frascos, colocar o recipiente em congelamento a-80oC freezer por pelo menos 4 horas. Alternativamente, o recipiente de congelamento podem ser deixados durante a noite a -80 oC. Repita esse processo para todos os recipientes de congelamento restantes.
- Transferir os criotubos do recipiente de congelamento (s) para um cryobox e coloque em um tanque de nitrogênio líquido para armazenamento de longo prazo.
2. Descongelamento e Cultivo de Blocos Congelados tecido cortical
Preparação de material
- Um dia antes de amostras de tecido de descongelamento, poli-L-lisina revestido Petri pratos / lamelas estão preparados. Em geral, para os neurônios corticais que preparam pratos revestido com 500 mcg / mL ou 1 mg / mL. Adicione o suficiente solução de poli-L-lisina (feita em tampão borato) para cobrir totalmente o fundo do prato. Se lamínulas de vidro são necessários, garantir que eles são completamente submerso na solução de poli-L-lisina. Incubar por pelo menos 12 hr. Antes de usar, lave os pratos com uma quantidade generosa de água estéril 3 vezes, 5 min cada.
- HBSS quente é usado para limpar o tecido descongelado, bem como dissociar o tecido em células em suspensão. O volume de HBSS necessário irá variar dependendo da quantidade de tecido a ser descongelado, mas normalmente um cryovial irá diluir em 50 mL de HBSS e será dissociada em 10 mL de HBSS.
- Modificado Dulbecco Medium Eagle com 10% de ferro suplementado bovinos soro bovino (EBS) e 1% antibiótico / antimicótico (AA) mistura (DMEM (++)) deve ser colocado em banho-maria a 37 ° C.
- Médio chapeamento (NB (+++)) deve ser feito fresco antes de usar. Este meio é preparado pela adição de 1% antibiótico / antimicótico mais B27 e suplementos N2.
Nota: Nomes de mídia anexados com cruzes (+) indicam a inclusão de aditivos à base de composição dos meios de comunicação. Neste texto, DMEM (+ +) denota DMEM acrescido de 10% EBS mais 1% AA, enquanto NB (+++) denota NB plnos 1% AA mais B27 além de N2.
Descongelamento e Cultivo
- Remova a criotubos do tanque de nitrogênio líquido e descongelamento rápido a 37 ° C em banho-maria até que apenas uma pequena pelota de gelo é observada dentro do conteúdo do frasco.
- Gentilmente transferir o conteúdo para frasco 50 ml de HBSS quente em um tubo cônico. Use uma ponta de orifício largo para desalojar qualquer gentilmente blocos tecido remanescente preso no cryovial. Inverter o tubo 3-4 vezes e permitir que o tecido para coletar lentamente na parte inferior. Tecido deve resolver rapidamente, mas se os blocos são muito pequenos isso não pode ocorrer e luz centrifugação (~ 200 x g) é recomendado.
- Aspirar HBSS excesso.
- Adicionar 10 mL de HBSS quente para o tecido da pelota e 300 mL de tripsina 0,25% e 50 mL de DNAase. Incubar em banho-maria a 37 ° C por 5 min, em seguida, coloque em um agitador orbital ajustado para 80 rpm e 37 ° C para um adicional de 5 min.
- Após este período, trazer os blocos de tecido em um gabinete de segurança biológica e usar uma pipeta 10 mL com cuidado agitar os blocos de tecido até obter uma suspensão celular nublado é formado. Desactivar a tripsina, adicionando 10 mL de DMEM quente (+ +) para a suspensão de células.
- Centrifugar as células dissociadas em 1200 x g por 5 min. Aspirar e desprezar o sobrenadante, ressuspender o pellet celular em 10 mL de DMEM quente (+ +) e quantificar o número de células usando um hemocitômetro.
- Células placa de poli-L-lisina pratos revestido. Tipicamente, um prato de 60 mm será revestida com 1x10 6 células.
- Permitir que as células para anexar ao prato / lamínulas durante aproximadamente 1 hora na cultura de tecidos incubadora. É recomendado para monitorar o progresso de apego em uma placa a cada 10 minutos até apego eficaz é observado. Então, gentilmente substituir o meio com DMEM fresco (++).
- Após 24 horas, substituir o DMEM (+ +) com água morna NB (+++). Alterações médias parciais (50%) são realizadas a cada 5 dias com novas NB (+++). Culturas saudáveis normalmente apresentam sinais de diferenciação e crescimento dos processos após 24 hrs. Sob essas condições, e realizando mudanças médio parcial a cada 4-5 dias, as culturas podem ser mantidas por períodos prolongados de tempo até 4-6 semanas.
- Para a geração de células precursoras neuronais (NPCs), um protocolo semelhante é usado com a ressalva de que após a centrifugação, DMEM sem EBS é usado. As células são plaqueadas em frascos T-25 em DMEM/F12 (1:3), suplementado com B27 e EGF (20 ng / mL) para permitir a formação de neuropheres. Para diferenciar NPCs, neurospheres são semeadas em laminina (10 ug / mL) lamínulas revestido em DMEM/F12 (1:3) meio suplementado com N2.
3. Resultados representante
Culturas saudáveis irá mostrar um crescimento significativo e diferenciação após 5 dias pós-descongelamento e normalmente irá estabilizar em seu crescimento por 10 dias (Figura 1). Coloração Immuncocytochemical destas culturas revela numerosos astrócitos (Figura 2A) e neurônios (Figura 2B), tanto para humanos e ratos culturas primárias neuronais. Este protocolo também é adequado para a geração de NPCs como livre-flutuante neurospheres (Figura 3A), que, em condições de diferenciação, resultam em culturas de alta qualidade mista (Figura 3B, C).
Figura 1. Culturas de células de tecidos humanos congelados cortical. Congelados humana blocos de tecido cortical são descongeladas e semeadas em poli-lisina lamínulas revestido e cresceu por 10 dias. De dia 5 expansão celular é aparente e por 10 dias confluência seja alcançado. Barra de escala: 100 mm.
Figura 2. Coloração imunocitoquímica de culturas de células. (A) As culturas foram coradas com o marcador glial fibrilar glial proteína ácida (GFAP, setas grossas). (B) Os neurônios foram detectados com o marcador neuronal beta-tubulina III (TIII, setas finas). (C) Ambas as culturas humanas e de ratos mostram abundantes e glia neurônios após 10 dias de cultura. Anticorpos primários: mouse anti-GFAP (1:1000) e de coelho anti-TIII (1:1000). Anticorpos secundários: anti-rato Alexa 594 (1:500) e anti-coelho Alexa 488 (1:500). Coloração núcleos: Hoestch azul (1:1000). Barra de escala: 50 mm.
Figura 3. Geração de neurospheres. (A) de tecido congelado foi processado como descrito acima e permissão para se propagar como neurospheres. (B) Neurospheres foram semeadas em lamínulas em condições de diferenciação e crescimento por 10 dias, resultando em células migram longe do neurosphere. (C) Ambos os neurônios e astrócitos estão presentes na franja expansão de um neurosphere diferenciação. Contracoloração nuclear, os anticorpos primário e secundário usado como na Figura 2.
Discussion
Criopreservação oferece a oportunidade de amostras de cérebro banco precioso tecido para uso futuro. Aqui nós descrevemos um protocolo simples, mas eficaz para gerar tanto neurônio enriquecido culturas e células precursoras neuronais a partir de blocos de tecido congelado cérebro. Este procedimento evita os custos econômicos das técnicas de criopreservação tradicionais que utilizam mais caro taxa controlada freezers. O protocolo permite a geração de culturas viáveis neuronal pós-descongelamento, proporcionando um meio rápido, mas eficaz para congelar blocos de tecido. O processo de congelamento completo pode demorar tão pouco como 20 minutos. Além de culturas primárias de neurônios, o uso desse blocos de tecido método também pode ser descongelado para gerar NPCs cresceu como livre neurospheres flutuante. A este respeito, a falta de soro no nosso meio de congelamento garante que as células são preservadas em um estado indiferenciado. Em condições de diferenciação, neurospheres produzido a partir de tecidos congelados de expansão show e as taxas de diferenciação muito comparável à neurospheres gerados a partir de tecido fresco.
Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Esta pesquisa foi suportada por concessões do Programa de Graduação Oportunidades de Pesquisa da UCI (AR e SP) e subvenções do Estado da Califórnia Initiative da doença de Alzheimer e os Institutos Nacionais de Saúde não conceder. HD38466, e doença de Alzheimer Research Center não conceder. AG16573 (JB)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Invitrogen | 11995-073 | High gluclose 1X |
| Bovine calf serum supplemented | Hyclone | SH30072.03 | For culture medium |
| Neurobasal-A Medium (1X), liquid | Invitrogen | 1088-022 | |
| B27 Supplement | Invitrogen | 17504-044 | Supplement for Neurobasal medium |
| N2 Supplement | Invitrogen | 17502-048 | Supplement for Neurobasal medium |
| Trypsin (10X) | Cellgro | 25-054CI | Tissue dissociation |
| Deoxyribonuclease 1 from bovine pancreas (DNase) | Sigma-Aldrich | D4527-30KU | Tissue dissociation |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) (10X) | GIBCO, by Life Technologies | 14065 | Cleaning tissue, washes, and freezing medium |
| Poly-L-Lysine- 500mg | Invitrogen | P2636 | Substrate for adhesion of neuronal cells |
| antibiotic-antimycotic (100X), liquid | Invitrogen | 15240-062 | To prevent contamination |
| Large orifice pipette Tips (1-200 ul) | Fisher Scientific | 02-681-141 | To prevent shear stress to cells |
| Graduated pipette tips (101-1000 ul) | USA Scientific, Inc. | 1111-2721 | |
| 21 G1 precision guide needles | BD Biosciences | 305165 | To clean tissue |
| 10 ml pipette | USA Scientific, Inc. | 1071-0810 | Individually wrapped |
| 50 ml tubes | USA Scientific, Inc. | 926-9-04 | |
| Single edge razor blade | Smith & Nephew Inc. | 67-0238 | To chop tissue |
| 60 x 15 mm polystyrene petri dish | USA Scientific, Inc. | 8609-0160 | For general culture |
| 100 x 15 mm polystyrene petri dish | USA Scientific, Inc. | 8609-0010 | For cleaning tissue |
| Cryogenic box | Nalge Nunc international | 5026-1010 | |
| Freezing container | Nalge Nunc international | 5100-0001 | "Mr. Frosty" |
| 2.0 ml cryogenic vials | Nalge Nunc international | 5012-0020 | |
| DMSO | Fisher Scientific | D128-500 | For freezing medium |
| Ethanol 200 proof | Sigma-Aldrich | E7023 | For sterilizing razor blade |
References
- Robbins, R. J. Cryopreservation of human brain tissue. Exp Neurol. 107, 208-213 (1990).
- Ware, C. B., Nelson, A. M., Blau, C. A. Controlled-rate freezing of human ES cells. Biotechniques. 38, 879-880 (2005).
- Paynter, S. J. Principles and practical issues for cryopreservation of nerve cells. Brain Res Bull. 75, 1-14 (2008).
- Thirumala, S., Gimble, J. M., Devireddy, R. V. Cryopreservation of stromal vascular fraction of adipose tissue in a serum-free freezing medium. J Tissue Eng Regen Med. 4, 224-232 (2010).
