Summary
يصف هذا البروتوكول في إعداد ركيزة الحمض الريبي النووي النقال الاصطناعية ل
Abstract
الطفيليات هي من بين العوامل المعدية الأكثر تدميرا للبشر مسؤولة عن مجموعة متنوعة من الأمراض بما في ذلك داء الأميبات ، وهو أحد الأسباب الثلاثة الأكثر شيوعا للوفاة من أمراض الطفيلية. وكيل الأميبات هو طفيل الأميبا المتحولة الحالة للنسج موجود تحت مرحلتين : كيسة المعدية موجودة في الغذاء أو الماء ، ويعيشون أتروفة الغازية في الأمعاء. المظاهر السريرية للداء الأميبات مجموعة من كونها أعراض التهاب القولون إلى خراجات والدوسنتاريا أو الكبد. E. نسج هو واحد من الطفيليات وحيدة الخلية ونادرة مع methylcytosine - 5 (5mC) في الجينوم. 1 ، 2 وهو يحتوي على الحمض النووي واحد methyltransferase ، Ehmeth ، الذي ينتمي إلى عائلة Dnmt2 2 دور لDnmt2 في السيطرة على العناصر المتكررة و أنشئت في E. نسج ، 3 Dictyostelium discoideum 4،5 وذبابة الفاكهة. أظهرت 6 عملنا الأخيرة التي Ehmeth methylates الحمض الريبي النووي النقال ASP ، وهذه النتيجة تشير إلى أن هذا الانزيم لديها الحمض النووي المزدوج / الحمض الريبي النووي النقال الحية النشاط methyltransferase 7 وهذه الملاحظة هي في الاتفاق مع النشاط المزدوج أنه تم الإبلاغ عن د. discoideum ودال. melanogaster 8 الأهمية الفنية للخصوصية الحمض النووي / الحمض الريبي النووي النقال من Dnmt2 الانزيمات لا يزال مجهولا. لمعالجة هذه المسألة ، وقد تم تأسيسها وسيلة لتحديد النشاط من الحمض الريبي النووي النقال methyltransferase Dnmt2 البروتينات. في هذا الفيديو ، وصفنا نهج مباشرة لإعداد الركيزة الحمض الريبي النووي النقال كافية لDnmt2 وطريقة لقياس نشاطها methyltransferase الحمض الريبي النووي النقال.
Protocol
مسبق قبل البدء في التجربة :
- ويستخدم الماء الخالي من ريبونوكلياز في التعامل مع من الحمض النووي الريبي في المختبر للحد من مخاطر من الحمض النووي الريبي التي تدهورت بفعل RNases. لهذا الغرض ، وعادة ما يتم التعامل مع المياه diethylpyrocarbonate V / V 0.1 ٪ (DEPC) لمدة لا تقل عن 1 ساعة عند 37 درجة مئوية وتعقيمها ثم (لا يقل عن 15 دقيقة) لتعطيل آثار DEPC.
- يتم تنظيف ماصات Pipetman بمحلول تطهير ريبونوكلياز (ريبونوكلياز خبير الإبادة والبيولوجية الصناعة بيت هعيمق) قبل الاستخدام.
- يجب أن تكون مصدقة أنابيب إيبندورف ونصائح مجانية من الدناز وريبونوكلياز إلى الحفاظ على سلامة العينة.
1. الحمض الريبي النووي النقال الحية التحضير
هذا الإجراء يصف في النسخ الاعادة المختبر والتي يمكن استخدامها لتوليف أي الحمض الريبي النووي النقال. هذا الإجراء هو التكيف مع أسلوب ribozyme سبق نشرها. 9 ولهذا الغرض تم تصميم قالب يتألف من المروج T7 ومكملة لتسلسل ribozyme المطرقة الشق الذاتي والحمض الريبي النووي النقال المطلوبة. نسخ من هذه النتائج في قالب منتج الشق نفسه في نهاية `5 في الطريقة التي يتم بها الحصول على كامل طول الحمض الريبي النووي النقال مع 5` - OH بدلا من نهاية فسفرته 5 `. يمكن تنقية الحمض الريبي النووي النقال كامل طولها من ribozyme المطرقة المشقوق ومنتجاتها من خلال الصفحات uncleaved اليوريا.
- PCR التمهيدي وتصميم قالب :
من أجل الحصول على قالب فعالة للتوسط RNA - T7 البلمرة في المختبر النسخ ثلاثة متطلبات يجب الوفاء بها.- تسلسل T7 - المروج (5 `- TAATACGACTCACTATA - 3`) يجب أن يكون تورط في القالب.
- لزيادة كفاءة النسخ ، وينبغي أن الثلاثة الأولى من النيوكليوتيدات RNA كتب تكون غوانوزين.
- هناك حاجة لتصحيح تسلسل الحمض الريبي النووي النقال التكميلية للمحددة.
- PCR
لتضخيم الحمض النووي من قالب ، استخدمنا تفاعل PCR القياسية في حجم النهائية من 50 ميكرولتر. الجدول 1 تفاصيل تركيزات النهائي (رد فعل على استعداد على الجليد) وبرنامج لPCR. درجة حرارة منخفضة الصلب المستخدمة خلال الحسابات الأولية 10 لدورات ملزمة إلا جزئية من التمهيدي إلى الأمام إلى القالب الحمض النووي. غير محددة ملزمة لخفض درجة الحرارة الصلب وزيادة لمزيد من التضخيم دورات 25.
تم اختبار نجاح التضخيم قالب من 1.3 ٪ agarose هلام prestained مع 1X حل GelRed (الشكل 2). - نسخ
- يمكن إعداد T7 بريميكس 5X تتركز (200 ملي تريس ، حمض الهيدروكلوريك ، ودرجة الحموضة 8.1 و 30 ملي MgCl 2 ، 1 سبيرمدين ملم ، 5 ملم DTT و 2 ميكروغرام / مل جيش صرب البوسنة وتريتون 0.01 ٪ X - 100) كانت تستخدم واحدة على الأقل أسبوع أو خمس دورات ذوبان التجميد.
- الخليط النسخ يجب أن تكون مستعدة في درجة حرارة الغرفة.
- وأعدت ردود الفعل النسخ باستخدام 80 ميكرولتر بريميكس T7 ، 80 ميكرولتر منتج PCR ، 80 ميكرولتر مزيج NTP (25 ملم) وتعديلها إلى 385 ميكرولتر MilliQ بالماء. تضاف 15 ميكرولتر (1.34 ملغ / مل) T7 RNA البلمرة (تركيز النهائي 0.05 ميكروغرام / ميكرولتر) لبدء التفاعل.
- وكان رد فعل قام بها لمدة 4 ساعات في 37 درجة مئوية. ويعجل البيضاء بيروفوسفات يشير النسخ ناجحة.
- تنقية
- وكان شباك بيروفوسفات أسفل لمدة 1 دقيقة في 10000 دورة في الدقيقة.
- تم تزويد Supernatants مع أحد formamid حجم التحميل صباغة وتنقيته على الصفحات باستخدام اليوريا 12 ٪20 واط لمدة 2 ساعة. ترجل الجل ووضعه على التفاف ساران.
- وصمة عار الجل مع الحل 3XGelRed تستكمل مع كلوريد الصوديوم 0.1 م لمدة 20 دقيقة. عند الإثارة الأشعة فوق البنفسجية ، تسمية الفرقة الحمض الريبي النووي النقال على التفاف ساران مع علامة دائمة للختان في وقت لاحق. بدلا من ذلك ، إذا كان العائد المتوقع هو 50 ميكروغرام العصابات أعلاه يتبين ذلك من خلال التظليل الأشعة فوق البنفسجية. التظليل عن الأشعة فوق البنفسجية ، وضع الجل على طبق من الفلورسنت اللوني الطبقة الرقيقة وتضيء مع مصباح الأشعة فوق البنفسجية مباشرة من فوق. نطاقات التسمية ، التي تبدو وكأنها غير الفلورسنت الظلال في هلام (الشكل 3) ، عن الختان في وقت لاحق.
- ويستأصل العصابات الحمض الريبي النووي النقال مع مشرط ووضعها في كوب إيبندورف 1.5 مل.
- بعد إضافة 450 ميكرولتر من 0.5M NH 4 عينات OAC يتم تجميدها في -80 درجة مئوية لمدة 2 ساعة وبعد ذلك تحضين عند 20 درجة مئوية ، والهز مع 550 دورة في الدقيقة على Thermoshaker إيبندورف طوال الليل. 6. يتم تصفيتها وطاف NH 4 حلول OAC من الخطوة 5 مع أنابيب Nanosep (0.45 ميكرون) ، والغزل 90 ثانية في 8500 دورة في الدقيقة لإزالة الحطام PAGE.
- تم تنفيذ ترسيب tRNAs eluted بإضافة 2.5 حجم -80 درجة مئوية الإيثانول النقي (سنويا) ، والتخزين في الطرد المركزي -20 درجة مئوية و 2.5 ساعة بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية ، ودورة في الدقيقة 15500.
- وبعد إزالة المجفف الكريات طاف في SpeedVac ومعلق في الماء MilliQ.
- وتحددت تركيزات باستخدام Nanodrop - ND1000. وكان العائد من النسخ 400 one ميكرولتر حول 80-100 ميكروغرام.
المشاكل :
- لا PCR المنتج. → هو تسلسل الاشعال والقالب متوافقة وكلها عناصر داخل خليط التفاعل؟
- لا النسخ المنتج. ربما كان → PCR ناجحة. الصحيح T7 - مروج تسلسل. باردة جدا في حين تستعد حلول التفاعل. T7 برميإكس قديمة جدا.
- المنتج على الجل ، ولكن أي منتج eluted. → الايثانول لهطول الأمطار ليس باردا بما فيه الكفاية ، وليس محض ، وليس حجم الصحيح.
2. التعبير وتنقية E. المؤتلف نسج Dnmt2 (Ehmeth) البروتين في E. القولونية BL21
هذا البروتوكول هو أيضا مناسبة لإعداد Dnmt2 البروتينات من الإنسان (10) وذبابة الفاكهة. 11
- وهاء تم تضخيمها نسج Ehmeth الجينات التي PCR ، المستنسخة في 4NT1 pGEX (GE علوم الحياة) والتحقق منها مع تسلسل
- تحولت البلازميد المؤتلف في E. القولونية (BL21) للتعبير عن البروتينات المؤتلف.
- وقد تم اختيار البكتيريا على تحويل لوريا ، Bertani (LB) آغار الأمبيسيلين (100 ميكروغرام / مل) المتوسط. واختير أربعة إلى خمسة وتحصين المستعمرات يصل إلى 5 مل من وسائل الاعلام LB مع علامة انتقائية مناسبة (100 ميكروغرام / مل الأمبيسيلين) ، وبين عشية وضحاها في المحتضنة شاكر المداري في 37 درجة مئوية.
- تم تلقيح ثقافة نمت بين عشية وضحاها الى 500 مل من 2X المتوسطة مستخلصات الخميرة (2XYT) تريبتون مع 100 ميكروغرام / مل أمبيسلين والمحتضنة في شاكر المداري 37 درجة مئوية في حين OD 600 من ثقافة وصلت 0.8.
- وكان المستحث على التعبير عن بروتين المؤتلف Dnmt2 بإضافة الآيزوبروبيل بيتا - D - thiogalactopyranoside (IPTG) بتركيز نهائي من 0.5 مم إلى الثقافة. وقد حضنت مزيد من الثقافة في المدار شاكر لمدة 16 ساعة على 24 درجة مئوية. وقد الأمثل للوقت ودرجة حرارة الحضانة لتجنب تشكيل هيئات الشمول.
- وكان طرد الثقافة في 4 درجات مئوية ، 6000 دورة في الدقيقة ، في 200 مل من أنابيب Nalgene لمدة 15 دقيقة. وقد تجاهل طاف وكان بيليه في تجميد -70 درجة مئوية على الأقل 1 ساعة. هذه الخطوة تجميد يحسن تحلل من البكتيريا.
- وكان حصاد بيليه في 30 مل من تحلل العازلة (100 ملي بوكل ، 1MM DTT ، 1MM PMSF ، 100 ميكروغرام / مل والليزوزيم Leupeptine 100 ميكروغرام / مل في الفوسفات عازلة المالحة (PBS)). من هذه النقطة ، من المهم للحفاظ على lysate على الجليد لمنع التعطيل من البروتين المؤتلف. وكان sonicated lysate في حمام جليد الماء عند وضع أي. 4 من MSE (لندن ، المملكة المتحدة) sonifier (عالية الطاقة ، السعة 5 و 30 ثانية النبض ، وباقي 30 ثانية لمدة 5 دقائق). تمت إزالة الحمض النووي البكتيرية التي يمكن ضمها الى Ehmeth مع العلاج Benzonase (Novagen) Nuclease (5 U / مل من lysate sonicated) ، لمدة 30 دقيقة على الجليد. تم الانتهاء من تحلل باضافة 300 ميكرولتر من البروتين BugBuster كاشف استخراج (Novagen) لمدة 30 دقيقة على 4 درجات مئوية في التحريض مع لطيف على مدار شاكر (100 دورة في الدقيقة).
- وكان تنقية المؤتلف GST - Ehmeth البروتين في ظل ظروف الأم على راتنج الجلوتاثيون ، agarose وفقا للتعليمات بتصنيع (سيغما). لمدة 25 مل من lysate تمت اضافة 500 ميكرولتر من الخرز الراتنج الطين والمحتضنة في 24 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
- وكانت تغسل حبات مرتين مع تحلل العازلة (10 مجلدا من تحلل العازلة في حجم حبات) و6 مرات مع PBS الباردة. هذه الخطوات يغسل واسعة تؤمن بأن هناك من لا تزال Benzonase قبل elutioن الخطوة.
- وكان eluted البروتين المؤتلف Ehmeth من الخرز agarose الجلوتاثيون التي يحتضنها حبات مع 5 مل من شطف العازلة الجلوتاثيون (تريس الرقم الهيدروجيني حمض الهيدروكلوريك 50 ملم 8.0 ، الجلوتاثيون (سيغما) 10 ملم) لمدة 12 ساعة في 4 درجات مئوية مع دوران طيف. أزيلت الخرز بواسطة الطرد المركزي (2000 دورة في الدقيقة ، 5 دقائق) وجمعت طاف.
- تم استبدال العازلة في شطف طاف بها العازلة التخزين (بوكل 200 مم ، EDTA 10 مم ، 0.1 ملي DTT ، الجلسرين 60 ٪ في برنامج تلفزيوني). لهذا الغرض ، تم تحميل 5 مل من طاف على الأعلى ميليبور Microcon YM - 30 أجهزة الطرد المركزي فلتر (30 كيلو دالتون قطع العمود) وطرد في 8000 دورة في الدقيقة لمدة 20 دقيقة على 4 درجات مئوية. وكان التركيز المخفف للبروتين في المخزن المؤقت التخزين (5 مل) وشحنها على جهاز التصفية. وينبغي تكرار نفس الإجراء على الأقل 3 مرات لضمان الاستبدال الكامل للشطف العازلة التي العازلة التخزين. وينبغي في النهاية أن تضعف البروتين تتركز في ما يقرب من 300 ميكرولتر من العازلة التخزين.
- وقد تم قياس تركيز البروتين المؤتلف من البروتين مقايسة برادفورد. تم تخزين تحضير الانزيم في المؤتلف -20 درجة مئوية. وينبغي التركيز النهائي للانزيم لا تقل عن 3 ميكروغرام / ميكرولتر باعتبارها مناسبة للتركيز على مقايسة مثيلة.
- وقد دققت في إعداد البروتين SDS - PAGE.
إشعار : لضمان إعداد أنزيم نشط ، ينبغي أن يتم تنقية جميع الخطوات على الجليد ، وينبغي DTT الطازجة ، وأضاف إلى المخزن المؤقت التخزين. يؤمن هذا الانزيم نشط لمدة 6 أشهر.
3. الفحص المختبري في مثلأيشن الحمض الريبي النووي النقال
حلول والكواشف التي ينبغي أن نكون مستعدين :
- 1 م حل aminomethane (hydroxymethyl) تريس. ضبط الرقم الهيدروجيني من الحل إلى 8.0 مع تركيز حمض الهيدروكلوريك (HCL).
- 5X العازلة مثلأيشن (MB) : 100 مم تريس الرقم الهيدروجيني 8.0 ، 100mM NH 4 OAC ، EDTA 0.1 ملم ، 10 ملم MgCl 2. يمكن أن تكون على استعداد للإخوان المسلمين في وقت مبكر وتخزينها على -20 درجة مئوية دون dithiothreitol (DTT).
- إعداد غير المسماة S - أدينوزيل مثيونين (AdoMet) البورصة (نهائي تركيز 1.5 ملم) ، عن طريق المزج 5 AdoMet ميكرولتر (نيو إنجلاند Biolabs ، 32 تركيز ملم) مع 101.67 مل من الماء المقطر.
- 5 ٪ محلول حمض التريكلوروسيتيك حمض (TCA)
- الإيثانول بنسبة 100 ٪
- التلألؤ السائل 3 مل لكل قارورة العينة.
المقايسة :
- ويتم إعداد مخطط pipeting (الجدول 2) من أجل وحدة تخزين 40 ميكرولتر النهائي للمقايسة مثيلة.
- في أنبوب 1.5 مل إيبندورف ، تم تخفيفه مع الحمض الريبي النووي النقال DEPC المياه المعالجة إلى تركيز النهائي من 5 ميكرومتر (الحمض الريبي النووي النقال 1μg ما يعادل 40 بمول)
- وأضيف 4 ميكرولتر من DTT (تركيز محلول المخزون) إلى 8 ميكرولتر من محلول 5XMB.
- وقد حضنت الحل الحمض الريبي النووي النقال في 85 أضيف درجة مئوية لمدة 2 دقيقة والحل أعد في الخطوة 3 على الفور لذلك. وقد سمح هذا الخليط ليبرد في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة للسماح للحظيرة الحمض الريبي النووي النقال بشكل صحيح.
- وقد أعد هذا المزيج AdoMet (تركيز النهائي 200 ميكرومتر) عن طريق خلط 50 ميكرومتر من AdoMet المسمى (250 μCi ، تسى 10.0 / ملمول ، PerkinElmer) مع 150 ميكرومتر من AdoMet غير المسماة. للحصول على مزيج مناسب لردود الفعل AdoMet وسم 10 ، ونحن مختلطة 5.2 ميكرولتر من AdoMet غير المسماة (من المحلول المخفف) ، و 29 ميكرولتر من AdoMet المسمى و 5.8 ميكرولتر من الماء المقطر.
- وأضيف 4 ميكرولتر من مزيج AdoMet أعد أعلاه إلى حل الحمض الريبي النووي النقال والمحتضنة لمدة 2 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
- وأضاف methyltransferase الحمض الريبي النووي النقال ، Ehmeth (1-10 ميكرومتر تركيز النهائي) إلى محلول يحتوي على الحمض الريبي النووي النقال الركيزة والعامل المساعد المسمى ، غير المسماة AdoMet. وقد حضنت الخليط لمدة 3 ساعات في 37 درجة مئوية. كانت مختلطة أنابيب بانتظام خلال فترة الحضانة من قبل التقليب برفق عليها. بنيت منحنى الحركية للتفاعل الأنزيمي من خلال اتخاذ كل 20 دقيقة على عينة (8 ميكرولتر) من مزيج رد فعل على مدى ثلاث ساعات.
- شوهد فورا كل عينة على مركز لتصفية Whatman (0.5 قطرها سم) وكان مرشح غارقة في محلول TCA 5 ٪ ، وتحريكها على الجليد لمدة 10 دقيقة (باستثناء عينة AdoMet ، E الجدول العمود 2 أنه لا ينبغي أن يكون غسلها). وتكرر هذه الخطوة مع الغسيل حل TCA 5 ٪ مرتين أكثر
- وكان يغسل فلتر مع الإيثانول بنسبة 100 ٪ على الجليد لمدة 10 دقيقة.
- كان فلتر الهواء المجفف لمدة لا تقل عن 20 دقيقة.
- وضعت كل مرشح المجففة في أنبوب (مواصفات) الذي شغل سابقا مع 3 مل من السائل التلألؤ (CytoScint)
- وكان النشاط الإشعاعي إدراجها في الحمض الريبي النووي النقال باستخدام عداد التلألؤ (بيتا عداد ثلاثي 2100TR كارب).
4. المشاكل
- القيم العالية في العمود A أو B (الجدول 3) ، وكانت القيم عينة مماثلة لتلك التي تحكم المتوقعة من رد فعل مثيلة في العمود C أو D (الجدول 3) → لم تغسل المرشحات بشكل صحيح.
- القيم المنخفضة في العمود C أو D (الجدول 3) ، وكانت تجارب مثيلة قيم مماثلة لمراقبة رد الفعل في العمود A أو B (الجدول 3) → لم يكن مستعدا للانزيم صحيح ، وهذا يعني أنه لا يوجد دمج Adomet. خيار آخر هو أن الحمض الريبي النووي النقال والمتدهورة ، وكان لا ركيزة مناسبة للانزيم ، ويمكن التحقق من هذا عن طريق تشغيل عينة الحمض الريبي النووي النقال على اليوريا هلام الأكريلاميد (انظر 1.2) ، وتلطيخ الجل مع بروميد إيثيديوم لفحص سلامة الحمض الريبي النووي النقال .
- تدني القيم في العمود D (الجدول 3) → منذ نشاط Ehmeth أضعف ثم يمكن تحسين أداء hDnmt2 الانزيم عن طريق زيادة تركيز DTT في المخزن المؤقت للتخزين (يمكن ان تتراوح بين 1 إلى 10 ملم) أو لزيادة تركيز الانزيم ل تلطيف نوعية رديئة من هذا الأنزيم.
- القيم المنخفضة في العمود E (الجدول 3) → هذا العمود يمثل النشاط الإشعاعي مجموع قيمة AdoMet المسمى (ويشار إلى 100 ٪) ، إذا كانت القيمة في هذا العمود هو منخفضة فهذا يعني أن AdoMet لم تعد نشطة وفقدت فيها النشاط الإشعاعي.
5. ممثل النتائج
| الكاشف | التركيز النهائي | PCR -- برنامج | |||||
| Gentherm PCR العازلة | 1X | 1. | 90 درجة مئوية | 2 دقيقة | |||
| MgCl 2 | 3.0 ملي | ------------------------------ | ------------------------------ | ||||
| dNTP مزيج | 1.2 ملم | 2. | 90 درجة مئوية | 30 ثانية | 5. | 90 درجة مئوية | 30 ثانية |
| قالب الحمض النووي | 15.0 نانومتر | 3. | 54 درجة مئوية | 30 ثانية | 6. | 60 درجة مئوية | 30 ثانية |
| إلى الأمام التمهيدي | 3.0 ميكرومتر | 4. | 72 ° C | 45 ق | 7. | 72 ° C | 45 ق |
| عكس التمهيدي | 3.0 ميكرومتر | 2. - 4. 10 دورات | 5. - 7. 25 دورة | ||||
| طق البلمرة | 0.1 U / ميكرولتر | ------------------------------ | ------------------------------ | ||||
| H 2 O | إعلان 50 ميكرولتر | الغطاء 95 درجة مئوية | 8. | 72 ° C | 3 دقائق | ||
الجدول رقم 1 : مخطط لالماصة PCR وبرنامج PCR.
| A السيطرة السلبية (Ehmeth فقط) | B السيطرة السلبية (الحمض الريبي النووي النقال فقط) | C الإيجابية التحكم مع Dnmt2 الإنسان | D معيار رد الفعل (Enz + + SUBST COF) | E إجمالي قيمة AdoMet على تصفية | |
| الحمض الريبي النووي النقال | -- | (3 ميكروغرام) | (3 ميكروغرام) | (3 ميكروغرام) | -- |
| hDnmt2 | -- | (2.48 ميكروغرام) | -- | ||
| Ehmeth | (2.48 ميكروغرام) | (2.48 ميكروغرام) | |||
| MB | 8 | 8 | 8 | 8 | -- |
| DTT | 4 | 4 | 4 | 4 | -- |
| AdoMet | 4 | 4 | 4 | 4 | 1 |
| أحواض دبي الجافة العالمية | -- | ||||
| مجموع | 40 ميكرولتر | 40 ميكرولتر | 40 ميكرولتر | 40 ميكرولتر | 1 ميكرولتر |
الجدول 2 : مثال على مخطط pipeting كل عمود في مخطط يمثل عينة واحدة.
* وتنصهر كل Ehmeth وhDnmt2 إلى علامة GST مع حجم يقدر البروتين من 62 كيلو دالتون.
A - السلبية السيطرة يتضمن فقط Ehmeth.
B - السيطرة السلبية التي تشمل الحمض الريبي النووي النقال فقط.
C - الإيجابية التحكم مع Dnmt2 الإنسان. هذا الانزيم ونشاط أكثر من مرة ten Ehmeth
D - الموحدة رد فعل يتضمن الانزيم ، الركيزة والعامل المساعد لل
E - إجمالي قيمة AdoMet على التصفية. يتم استخدام هذه القيمة لحساب النسبة المئوية لدمج مجموعة الميثيل.
| A السيطرة السلبية (Ehmeth فقط) | B السيطرة السلبية (الحمض الريبي النووي النقال فقط) | C الإيجابية التحكم مع Dnmt2 الإنسان | D معيار رد الفعل (Enz + + SUBST COF) | E إجمالي قيمة AdoMet على تصفية | |
| الاجتماع التحضيري للمؤتمر | 200 | 300 | 6700 | 1284 | 51653 |
الجدول 3 : مثال للقيم قرأه العداد التلألؤ كل عمود في مخطط يمثل عينة واحدة من الجدول رقم 1.
الشكل 1 : (أ) T7 قالب النسخ والنسخ في الاشعال عن المختبر. مكتوبة في جميع متواليات 5 'إلى 3' الاتجاه. Colorcode : انظر النص. (ب) خطة لتشكيل المنتج أثناء النسخ. ويتم تصنيع الحمض النووي الريبي التي نص بوليميريز RNA T7. المطرقة ribozyme وأضعاف الحمض الريبي النووي النقال في الهياكل - 2D كل منهما ، ويشق على نفسه ribozyme من الحمض الريبي النووي النقال تاركا مجموعة الهيدروكسيل في نهاية 5' - بهم (مقتبس من 9).
وترد PCR السيطرة على رد فعل على 1.3 ٪ agarose هلام prestained مع 1X تفاعلات PCR GelRed على اثنين من القوالب المختلفة الى جانب basepairs 100 زائد سلم : الشكل 2. الضوابط تشمل "القالب فقط" حارة وردود الفعل التي حذفت التمهيدي عكسي.
الشكل 3 : الأشعة فوق البنفسجية التظليل هو مبين في الفصل PAGE مخاليط النسخ اثنين. نطق النصوص السلائف (قبل الانقسام) ، كامل الحمض الريبي النووي النقال طول وribozyme المطرقة تصبح مرئية والظلال لأنها تمنع الأشعة فوق البنفسجية من الوصول إلى لوحة TLC الفلورسنت. مجموع من الحمض الريبي النووي النقال E. كما يتم استخدام علامة القولونية الحجم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في هذا العرض ، ويتضح لنا كيفية تحضير المكونات النشطة لقياس النشاط methyltransferase الحمض الريبي النووي النقال من E. نسج Ehmeth الانزيم. هذا الإجراء يمكن أن تكون بمثابة نقطة انطلاق ويمكن تكييفها بسهولة لقياس methyltransferases الحمض الريبي النووي النقال الأخرى. من المهم أن تتبع الإجراءات التي تحافظ على جودة وسلامة الركيزة الحمض الريبي النووي النقال من البروتين والحمض الريبي النووي النقال methyltransferase لضمان التدبير الأمثل للنشاط الأنزيمي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وأيد هذه الدراسة من المنح المقدمة من مؤسسة العلوم إسرائيل ومعهد عائلة رابابورت للبحوث في مجال العلوم الطبية ، وجمعية الألمانية للبحوث (DFG).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Taq Polymerase (5 U/μl) | Rapidozym, Berlin | GEN-003-1000 | |
| 10X Gentherm PCR Buffer | Rapidozym, Berlin | With GEN-003-1000 | |
| MgCl2 (50 mM) | Rapidozym, Berlin | With GEN-003-1000 | |
| dNTP mix (10 mM) | Fermentas | R0191 | |
| Oligo nucleotides | IBA, Göttingen | Customized | |
| NTP mix (25mM) | Fermentas | R0481 | |
| GelRed Nucleic Acid Stain 3X in water | Biotium, Inc. | 41001 | |
| Dithiotreitol | Fermentas | R0861 | |
| Spermidine | Sigma-Aldrich | S0266 | |
| Pall Nanosep 0.45 μm | Sigma-Aldrich | Z722014 | |
| Dichlorodimethylsilane | Sigma-Aldrich | 40140 | |
| Ethanol (Ph. Eur.) | Carl Roth Gmbh | 5054.3 | |
| Tris HCl | Carl Roth Gmbh | 9090.3 | |
| Tris | Carl Roth Gmbh | AE15.1 | |
| BSA | Fermentas | B14 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| TEMED | Carl Roth Gmbh | 2367.1 | |
| Ammonium Peroxodisulfate | Carl Roth Gmbh | 9592.2 | |
| Rotiphorese Sequencing gel concentrate | Carl Roth Gmbh | 3043.1 | |
| Rotiphorese Sequencing gel diluent | Carl Roth Gmbh | 3047.1 | |
| Rotiphorese Sequencing gel buffer concentrate | Carl Roth Gmbh | 3050.1 | |
| Rotiphorese 10X TBE-buffer | Carl Roth Gmbh | 3061.2 | |
| DEPC | Sigma-Aldrich | D5758 | |
| RNAse ExTERMINATOR | Biological Industries | 01-895-1B | |
| Ampicillin | Sigma-Aldrich | A0166 | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758 | |
| PMSF | Sigma-Aldrich | P7626 | |
| Lysozyme | Sigma-Aldrich | L7651 | |
| Leupeptine | Sigma-Aldrich | L2884 | |
| Benzonase Nuclease | Novagen, EMD Millipore | 70746-3 | |
| BugBuster protein extraction reagent | Novagen, EMD Millipore | 70921-3 | |
| Glutathione-agarose resin | Sigma-Aldrich | G4510 | |
| L-glutathione reduced | Sigma-Aldrich | G4251 | |
| AdoMet | New England Biolabs | B9003 | |
| AdoMet 3H | PerkinElmer, Inc. | NET155250UC | |
| Scintillation Cocktail | CytoScint | 882453 |
References
- Banerjee, S., Fisher, O., Lohia, A., Ankri, S. Entamoeba histolytica DNA methyltransferase (Ehmeth) is a nuclear matrix protein that binds EhMRS2, a DNA that includes a scaffold/matrix attachment region (S/MAR). Mol Biochem Parasitol. 139, 91-97 (2005).
- Fisher, O., Siman-Tov, R., Ankri, S. Characterization of cytosine methylated regions and 5-cytosine DNA methyltransferase (Ehmeth) in the protozoan parasite Entamoeba histolytica. Nucleic Acids Res. 32, 287-297 (2004).
- Harony, H., Bernes, S., Siman-Tov, R., Ankri, S. DNA methylation and targeting of LINE retrotransposons in Entamoeba histolytica and Entamoeba invadens. Mol Biochem Parasitol. 147, 55-63 (2006).
- Kuhlmann, M. Silencing of retrotransposons in Dictyostelium by DNA methylation and RNAi. Nucleic Acids Res. 33, 6405-6417 (2005).
- Katoh, M. Developmentally regulated DNA methylation in Dictyostelium discoideum. Eukaryot Cell. 5, 18-25 (2006).
- Phalke, S. Retrotransposon silencing and telomere integrity in somatic cells of Drosophila depends on the cytosine-5 methyltransferase DNMT2. Nat Genet. 41, 696-702 (2009).
- Tovy, A., Siman Tov, R., Gaentzsch, R., Helm, M., Ankri, S. A new nuclear function of the Entamoeba histolytica glycolytic enzyme enolase: the metabolic regulation of cytosine-5 methyltransferase 2 (Dnmt2) activity. PLoS Pathog. 6, e1000775-e1000775 (2010).
- Jeltsch, A., Nellen, W., Lyko, F. Two substrates are better than one: dual specificities for Dnmt2 methyltransferases. Trends Biochem Sci. 31, 306-308 (2006).
- Fechter, P., Rudinger, J., Giege, R., Theobald-Dietrich, A. Ribozyme processed tRNA transcripts with unfriendly internal promoter for T7 RNA polymerase: production and activity. FEBS Lett. 436, 99-103 (1998).
- Hermann, A., Schmitt, S., Jeltsch, A. The human Dnmt2 has residual DNA-(Cytosine-C5)-methyltransferase activity. J Biol Chem. 278, 31717-31721 (2003).
- Narsa Reddy, M., Tang, L. Y., Lee, T. L., &, T. L., James Shen, C. K. A candidate gene for Drosophila genome methylation. Oncogene. 22, 6301-6303 (2003).
