Optimierte Reinigung von Plasmid-DNA aus prokaryontischen Kulturen

Summary

Dieses Protokoll ist eine kostengünstige Alternative für eine effiziente parallele Klärung und Plasmid-DNA Aufreinigung aus

Abstract

Wir beschreiben den gesamten Prozess der AcroPrep Advance-Filterplatten für 96 Plasmid-Präparationen, ab prokaryotischen Kultur und endend mit hoher Reinheit DNA. Basierend auf Multi-Well-Filtration für Bakterienlysat Luft-und DNA-Aufreinigung, erstellt diese Methode eine optimierten Prozess für Plasmid-Präparation. Filter-Platten mit Silica-basierte Medien können durch Vakuum-Filtration oder Zentrifuge nennenswerte Mengen von Plasmid-DNA-Ausbeute verarbeitet werden. Quantitative Analysen bestimmen die gereinigte Plasmid-DNA wird konsequent von hoher Qualität mit einer durchschnittlichen OD _260/280 Verhältnisse von 1,97. Insgesamt bieten Plasmid Erträge reiner DNA für nachgelagerte Anwendungen wie Sequenzierung und Klonierung. Dieser optimierte Methode zur Verwendung von AcroPrep Advance-Filterplatten ermöglicht die manuelle, halbautomatische oder vollautomatische Verarbeitung.

Protocol

1. Lysate Abstand

1. Wachsen E. coli-Kulturen mit der gewünschten Plasmid-DNA in Deep Well Platten (1 mL Kultur / well) in Luria Broth mit geeigneten Antibiotika über Nacht bei 37 ° C unter Schütteln verwandelt.
2. Pellet E. coli in Kulturplatte bei 5.000 xg für 10 Minuten, dann dekantieren.
3. Resuspendieren jedes Pellet in 100 ul Resuspensionspuffer (50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 10 mM EDTA, 100 ug / mL RNase A).
4. 100 l / well Lysispuffer (200 mM NaOH, 1% SDS) und schütteln mit Schüttler für 2 Minuten.
5. 100 l / well Neutralisierungspuffer (3,0 M Kaliumacetat, pH 5,5) und schütteln Sie für 2 Minuten.
6. Transfer-Zelllysat zur Klärung Platte Lysat.
7. Legen DNA-Bindung Platte auf der Oberseite von 350 ul Sammlung Platte aufnehmen und in unteren Vakuumkammer. Montieren Vakuumkammer (siehe Abbildung 1).
8. Legen Sie Lysat Klärung Platte oben auf Vakuumapparatur.
9. Bewerben Vakuum bei 10 in. Hg (0,34 bar) und sammeln Filtrat in DNA-Bindung Platte. Verwenden Sie keine Vakuum größer als 12 Zoll Hg. (0,41 bar).
10. Demontieren Vakuumkammer. Platz 2 mL Abfallsammlung Platte im unteren Teil des Gerät.

2. DNA-Bindung

1. Bewegen Sie die DNA-Bindung Platte an der Spitze der Verteiler (siehe Abbildung 2).
2. Geben Sie 300 ul / well Binding Buffer (6 M Guanidin-HCl) und Pipette auf und ab zu mischen.
3. Bewerben Vakuum [~ 5 Zoll Hg (0,17 bar) für langsame Vakuum] und entsorgen Filtrat. DNA ist nun verpflichtet, Membran.
4. Waschen mit 400 ul / well Waschpuffer (80% Ethanol).
5. Bewerben Vakuum, dann verwerfen das Filtrat. Entsorgen Sie nicht erforderlich, wenn mit 2 mL Sammlung Platte oder Filterung direkt zu verschwenden.
6. Wiederholen Sie waschen einmal.
7. Blot unteren Filterplatte auf saugfähigen Tuch zu trocknen.
8. Bewerben Vakuum noch einmal für 5-10 Minuten, um das Entfernen von Restalkohol zu gewährleisten.
9. Blot unten nach Entfernung von Ethanol Tröpfchen zu gewährleisten.

3. DNA Elution

1. Fügen Sie 70 ul / Vertiefung Elutionspuffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA). Werden höhere DNA-Konzentration gewünscht wird, kann ein Volumen von 50 ul / Vertiefung reduziert werden, aber der durchschnittliche Gesamtertrag niedriger sein wird.
2. Die Platte bei Raumtemperatur für 1 Minute.
3. Gereinigte DNA kann entweder durch Vakuum oder Zentrifugation eluiert werden.
4. Vakuum-Methode: Zeigen saubere Sammlung Platte (DNase, RNase frei) in Vakuumkammer. Platzieren Sie den Filter an der Oberseite Vakuumkammer, gelten Vakuum bei 15 in. Hg (0,5 bar) für 1 Minute, bis alle Elutionspuffer durch die DNA-Bindung Platte passiert hat. Sammeln gereinigte DNA (siehe Abbildung 3).
5. Zentrifugation Methode: Zeigen Reinigungsfilter Platte oben auf saubere Sammlung Platte und Zentrifuge bei 1.000 xg für 5 Minuten.

4. Quantitative und qualitative Analysen

1. Messen OD _260/280, berechnen Konzentration der gereinigten DNA.
2. Führen Agarosegel-Analyse der gereinigten pDNA.

5. Repräsentative Ergebnisse

E. coli-Lysat geklärt Verwendung traditioneller Zentrifugation und Pall AcroPrep Advance-Lysat Klärung Filterplatten zeigte spürbare Verringerung der Schmutz von Ausgangsmaterial. (Abbildung 4).

Plasmid-DNA bei drei Konzentrationen wurde in TE-Puffer versetzt und durch die AcroPrep Advance-Lysat Klärung Filterplatte. Ein Vergleich von Plasmid-DNA-Konzentration, Pre-und Post-Filtration ~ zeigt 100% Wiederherstellung (Abbildung 5) bei allen drei Konzentrationen.

Um die Gewinnung von DNA aus E. geklärt demonstrieren coli-Lysat, Plasmid-DNA wurde in Rohlysat versetzt und dann durch Filtration geklärt. Das gleiche Plasmid-DNA wurde Zelllysat nach der Filtration zugesetzt. Die Elektrophorese wurde auf Aliquots von jeder Probe (Abbildung 6) durchgeführt. Eine einzige, klare Bande von ähnlicher Intensität aus jeder Probe zeigt wenig oder gar keine DNA-Verlust bei der Filtration-basierte Klärung Schritt.

Kulturen von E. coli mit pCAT Plasmid-DNA wurden von E. gereinigt coli-Lysaten mit Pall 350 &mgr; l und 1 ml DNA-bindende Filterplatten, sowie zwei andere Marken von 350 ul DNA-Bindung-Platten. Alle Reinigungen wurden durchgeführt, wie in dem vom Hersteller empfohlenen Protokoll spezifiziert. Die höchste DNA-Konzentration und Gesamtertrag aus Pall 1 mL AcroPrep Advance-DNA-Aufreinigung Filterplatte (Abbildung 7 und Tabelle 2) zu sehen.

Obwohl Wettbewerber W zeigt zudem eine hohe DNA-Konzentration (155 ng / mL), ist die totale DNA-Ausbeute der niedrigsten (4,7 pg / well) aufgrund der niedrigen Wiederherstellungs-Volume, ~ 30 ul. Wettbewerber M gab die niedrigste Konzentration von DNA bei 108 ng / ul mit einer Gesamtausbeute von 5,6 pg / well.

Agarose-Gel-Analyse von gereinigtem pCAT DNA aus den drei verschiedenen DNA-bindenden Platten ist in Abbildung 8 dargestellt. Jede Sammelprobe Volumen wurde auf 65 ul eingestellt werden, um Unterschiede in der Wiederherstellungs-Volume vor der Elektrophorese zu korrigieren. Alle Proben zeigen, Plasmid-DNA supercoiled, aber DNA-Ausbeute aus jedem der Filterplatten variiert.

Abbildung 9 zeigt die vorbereitete DNA ist alles in supercoiled Form und hat eine ähnliche Konzentration.

Abbildung 1. Montage von Vakuum-Manifold für Lysate Klarstellung.

Abbildung 2. Montage von Vakuum-Manifold für die DNA-Binding.

Abbildung 3. Montage von Vakuum-Manifold für Vakuum-Elution.

Abbildung 4. Filtration vereinfacht Probe Klärung. Dreifachen Proben von 300 ul Rohlysat durch Vakuumfiltration (350 ul AcroPrep Advance-Lysat Klärung Filterplatte) oder traditionellen Zentrifugation geklärt. OD ₃₂₀ vor und nach der Klärung gemessen.

Abbildung 5. Vollständige Wiederherstellung von pDNA nach dem Durchgang durch AcroPrep Advance-Lysat Klärung Filterplatte. 300 ul TE-Puffer mit pCAT bei 25, 50 und 100 ug / ml versetzt. DNA-Konzentration und Erholung von OD ₂₆₀ vor und nach der Filtration, N = 2 berechnet.

Abbildung 6. Rückgewinnung von pCAT DNA nach Klärung. Gleiche Mengen von pUC19 in Lysat vor oder nach Klärung versetzt, dann verdünnt 1 bis 10 in TE-Puffer. Loaded 2 ul / Spur auf 1,2% Agarosegel.

Abbildung 7. Höhere Plasmid DNA-Ausbeute pro Well mit Pall AcroPrep Advance-DNA-Bindung Filterplatte als Konkurrent Platten. PCAT Plasmid-DNA Ausbeute (OD ₂₆₀₎ mit angegeben DNA-Aufreinigung Platten mit 1 mL (Pall und Wettbewerber M) oder 1,5 ml (Wettbewerber W)-Nacht-Kultur DH5a. Reinigung mit Platte vom Hersteller empfohlenen Protokoll. Fehlerbalken zeigen Standardfehler (n> 6).

Abbildung 8. Agarose-Gel-Analyse von DNA pCAT am angegebenen DNA-Bindung Platte gereinigt. 1,2% Agarose-Gelelektrophorese des gereinigten pDNA. Gepoolten Proben aus drei verschiedenen Reinigungen, Eluat auf 65 ul nach der Reinigung, 1:10 eingestellt. Loaded 2 ul pro Bahn.

Abbildung 9. Qualität und Gewinnung von reiner DNA ähnlich, wenn Zentrifuge oder Vakuum-Verfahren für die endgültige Eluat Sammlung Agarosegelelektrophorese des gereinigten pDNA verwendet werden. Die vom Hersteller empfohlene Protokoll für AcroPrep Advance-Filterplatten wurde pDNA Reinigung gefolgt. Die Elution wurde durch Zentrifugieren bei 1.000 xg für 5 Minuten oder Vakuum mit 15 Zoll Hg (0,5 bar) für 2 Minuten durchgeführt.

Discussion

Wir beschreiben eine einfache, optimierte Protokoll AcroPrep Advance-Filterplatten, dass eine Reihe von Vorteilen bietet. Diese Methode bietet ein Maximum an Plasmid-DNA liefert, wenn im manuellen, teilautomatisierten oder vollautomatisierten AcroPrep Advance-Formate verarbeitet. Ein integrierter Vorfilter auf dem Lysat Abstand Platte sorgt für konsistente Filtration von Proben, auch solche mit einem hohen Gehalt an Partikeln. Die Well-Geometrie der Platte führt zu einer schnelleren, gleichmäßigeren Abscheidegrade über die Platte mit minimalem Totvolumen und die Steckdose Spitzengeometrie bietet direkten Durchfluss von Proben in den Receiver Platte ohne Bedenken von Kreuzkontamination. Wichtig ist, dass die hohe Bindekapazität Membran in DNA-Bindung Teller AcroPrep Advance-Filterplatten für maximale Rückgewinnung hochwertiger Plasmid-DNA optimiert.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
AcroPrep Advance Filter plate	Pall Corporation	PN 8175 (1 mL) or PN 8075 (350 µl)	3 μm glass fiber 0.2 μm Supor® membrane for clarification
AcroPrep Advance Filter Plate	Pall Corporation	PN 8132	for DNA Binding
Vacuum manifold	Pall Corporation	PN 5017
Vacuum pressure pump	Pall Corporation	PN 13157