Gestroomlijnde Zuivering van Plasmide DNA Van Prokaryote culturen

Summary

Dit protocol is een kosteneffectief alternatief voor een efficiënte parallelle verduidelijking en plasmide DNA zuivering uit

Abstract

Beschrijven we het volledige proces van AcroPrep Advance Filter Platen voor 96 plasmide bereidingen, vanaf prokaryotische cultuur en eindigend met een hoge zuiverheid DNA. Op basis van multi-en filtratie voor bacteriële lysaat opruiming en DNA-zuivering, deze methode zorgt voor een gestroomlijnd proces voor plasmide voorbereiding. Filter platen met silica-gebaseerde media kan gemakkelijk worden verwerkt door vacuüm filtratie of centrifuge om aanzienlijke hoeveelheden plasmide DNA opbrengst. Kwantitatieve analyses bepalen het gezuiverde plasmide DNA is constant van hoge kwaliteit met een gemiddelde OD _260/280 verhouding van 1,97. Over het algemeen levert plasmide bieden meer pure DNA voor downstream-toepassingen, zoals sequencing en klonen. Deze gestroomlijnde methode voor het gebruik van AcroPrep Advance filterplaten zorgt voor handmatig, semi-automatische of volledig geautomatiseerde verwerking.

Protocol

1. Lysaat Clearance

1. Grow E. coli culturen getransformeerd met de gewenste plasmide DNA in diepe borden goed (1 ml van de cultuur / putje) in Luria bouillon met een geschikte antibiotica 's nachts bij 37 ° C met schudden.
2. Pellet E. coli in de cultuur plaat bij 5.000 xg gedurende 10 minuten, daarna overgieten supernatant.
3. Resuspendeer elke pellet in 100 ui resuspensie buffer (50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 10 mM EDTA, 100 ug / ml RNase A).
4. Voeg 100 ul / well Lysis Buffer (200 mM NaOH, 1% SDS) en schud met behulp van plaat shaker gedurende 2 minuten.
5. Voeg 100 ul / well neutralisatie buffer (3,0 M kaliumacetaat, pH 5.5) en schud gedurende 2 minuten.
6. Overdracht cellysaat om opheldering plaat lysaat.
7. Plaats DNA-bindend bord op de top van 350 pi collectie platen en plaats in de onderkant van vacuüm manifold. Monteer vacuum spruitstuk (zie figuur 1).
8. Plaats lysaat verduidelijking bord op de top van vacuüm apparatuur.
9. Van toepassing zijn vacuüm bij 10 inch Hg (0,34 bar) en verzamel het filtraat in DNA-binding plaat. Gebruik geen stofzuiger meer dan 12 inch Hg. (0,41 bar).
10. Demonteer vacuum spruitstuk. Plaats 2 mL inzameling van afval plaat in de bodem van apparaten.

2. DNA-Bindende

1. Verplaats de DNA-binding plaat aan de bovenkant van het spruitstuk (zie figuur 2).
2. Voeg 300 ul / putje Binding Buffer (6 M Guanidine-HCl) en de pipet op en neer om te mengen.
3. Van toepassing zijn een vacuüm [~ 5 inch Hg (0,17 bar) voor langzaam vacuüm] en gooi filtraat. DNA is nu gebonden aan membraan.
4. Was met 400 pl / putje van Wash Buffer (80% ethanol).
5. Van toepassing zijn vacuüm, gooi het filtraat. Gooi niet nodig bij gebruik van 2 mL collectie bord of filtering direct naar afval.
6. Herhaal wassen een keer.
7. Blot onderkant van het filter plaat op absorberende handdoek om te drogen.
8. Van toepassing zijn vacuüm eens meer voor 5-10 minuten om de verwijdering van de resterende alcohol te verzekeren.
9. Blot onderkant om de verwijdering van ethanol druppels te verzekeren.

3. DNA Elutie

1. Voeg 70 pl / putje elutiebuffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA). Als hogere DNA-concentratie gewenst is, kan het volume worden teruggebracht tot 50 ul / putje, maar de gemiddelde totale opbrengst lager zal zijn.
2. Incubeer de plaat bij kamertemperatuur gedurende een minuut.
3. Gezuiverde DNA kan worden geëlueerd door een vacuüm of centrifugeren.
4. Vacuum methode: Plaats clean collectie plaat (DNase, RNase vrij) in vacuum spruitstuk. Plaats filter bord op de top van vacuüm-manifold, van toepassing vacuüm bij 15 inch Hg (0,5 bar) gedurende 1 minuut totdat alle elutiebuffer heeft doorgegeven via de DNA-binding plaat. Verzamel gezuiverde DNA (zie figuur 3).
5. Centrifugatie methode: Plaats zuivering filter bord op de top van schone collectie platen en centrifugeer bij 1000 xg gedurende 5 minuten.

4. Kwantitatieve en kwalitatieve analyses

1. Meten OD _260/280, bereken de concentratie van het gezuiverde DNA.
2. Voer agarosegel analyse van het gezuiverde pDNA.

5. Representatieve resultaten

E. coli lysaat verduidelijkt met behulp van traditionele centrifugeren en Pall AcroPrep Advance lysaat verduidelijking filterplaten toonde aanzienlijke vermindering van puin van uitgangsmateriaal. (Figuur 4).

Plasmide DNA bij drie concentraties werd spiked in TE-buffer en door de AcroPrep Advance lysaat verduidelijking filter plaat. Een vergelijking van plasmide DNA-concentratie, pre-en post-filtratie, shows ~ 100% herstel (figuur 5) bij alle drie de concentraties.

Het herstel van DNA van E. verduidelijkt aan te tonen coli lysaat, plasmide DNA werd spiked in ruwe lysaat en daarna door filtratie. Dezelfde plasmide DNA werd toegevoegd aan cellysaat na filtratie. Elektroforese werd uitgevoerd op aliquots van elk monster (Figuur 6). Een enkele, duidelijke band van vergelijkbare intensiteit van elk monster toont weinig of geen DNA verlies tijdens de filtratie-based verduidelijking stap.

Culturen van E. coli met pCAT plasmide DNA werd gezuiverd van E. coli lysaten met behulp van Pall's 350 pi en 1 ml DNA-binding filterplaten, evenals twee andere merken van 350 pi DNA-binding platen. Alle zuiveringen werden uitgevoerd zoals aangegeven in aanbevolen protocol van de fabrikant. De hoogste DNA-concentratie en de totale opbrengst worden gezien van de Pall is een mL AcroPrep Advance DNA-zuivering filter plaat (figuur 7 en tabel 2).

Hoewel Concurrent W toont ook een hoge DNA-concentratie (155 ng / pl), de totale DNA-opbrengst is het laagst (4,7 ng / putje) als gevolg van de geringe hoeveelheid volume, ~ 30 pi. Concurrent M gaf de laagste concentratie van het DNA bij 108 ng / ul met een totale opbrengst van 5,6 g / goed.

Agar-agarose gel-analyse van gezuiverde pCAT DNA van de drie verschillende DNA-binding platen is weergegeven in Figuur 8. Elke verzamelde monstervolume werd aangepast om 65 ul om te corrigeren voor verschillen in herstelvolume voorafgaand aan de elektroforese. Alle monsters tonen supercoiled plasmide DNA, maar DNA-opbrengst van elk van de filterplaten varieert.

Figuur 9 toont de bereide DNA is allemaal in helix vorm en heeft vergelijkbare concentratie.

Figuur 1. Vergadering van Vacuüm Manifold voor Lysate verduidelijking.

Figuur 2. Vergadering van Vacuüm Manifold voor DNA-binding.

Figuur 3. Vergadering van Vacuüm Manifold voor Vacuum Elutie.

Figuur 4. Filtratie vereenvoudigt de sample verduidelijking. Drievoud monsters van 300 ul van ruwe lysaat verduidelijkt door vacuümfiltratie (350 pL AcroPrep Advance lysaat verduidelijking filter plaat) of traditionele centrifugeren. OD ₃₂₀ gemeten vóór en na de verduidelijking.

Figuur 5. Volledig herstel van pDNA na het doorlopen van AcroPrep Advance lysaat verduidelijking filter plaat. 300 pi TE-buffer verrijkt met pCAT bij 25, 50 en 100 ug / ml. DNA-concentratie en herstel berekend op basis van OD ₂₆₀ voor en na filtratie, N = 2.

Figuur 6. Herstel van pCAT DNA na verduidelijking. Gelijke hoeveelheden van pUC19 spiked in lysaat voor of na de verduidelijking, vervolgens worden verdund 1 tot 10 van TE-buffer. Geladen 2 pl / rijstrook op 1,2% agarose gel.

Figuur 7. Hogere plasmide DNA opbrengst per goed met pall Acroprep Advance DNA-binding filterplaat dan concurrerende platen. PCAT plasmide DNA opbrengst (OD ₂₆₀₎ met behulp van DNA-zuivering aangegeven platen met 1 ml (Pall en concurrent M) of 1,5 ml (Concurrent W) 's nachts de cultuur van DH5a. Zuivering met behulp van een constructieplaat aanbevolen protocol. Foutbalken geven standaardfout (n> 6).

Figuur 8. Agarosegel analyse van pCAT DNA gezuiverd op aangegeven DNA-binding plaat. 1,2% agarosegel elektroforese van het gezuiverde pDNA. Gepoolde monsters van drie verschillende zuiveringen, eluaat aangepast aan 65 uL na zuivering, 1:10 verdund. Geladen 2 pl per rijstrook.

Figuur 9. Kwaliteit en het herstel van pure dna vergelijkbaar wanneer een centrifuge of vacuüm methodes worden gebruikt voor de uiteindelijke eluaat collectie agarosegelelektroforese van het gezuiverde pDNA. Door de fabrikant aanbevolen protocol voor AcroPrep Advance filterplaten werd gevolgd voor de pDNA zuivering. Elutie werd uitgevoerd door centrifuge bij 1000 xg gedurende 5 minuten of stofzuiger met 15 inch Hg (0,5 bar) gedurende 2 minuten.

Discussion

Beschrijven we een gemakkelijke, gestroomlijnde protocol van AcroPrep Advance filterplaten dat verschillende voordelen biedt. Deze methode biedt maximale plasmide DNA opbrengst bij verwerking in de handmatige, semi-automatische, of volledig geautomatiseerde AcroPrep Advance formaten. Een geïntegreerde voorfilter op de lysaat klaring plaat biedt een consistente filtratie van de monsters, zelfs die met hoge niveaus van fijn stof. Het goed geometrie van de plaat resulteert in een snellere, meer uniforme filtratiesnelheid over de plaat met een minimale hold-up volume, en de uitlaat tip geometrie biedt directe doorstroming van de monsters in de ontvanger plaat zonder zorgen van kruisbesmetting. Belangrijk is dat de hoge bindingscapaciteit membraan in DNA-binding plaat van AcroPrep Advance filterplaten geoptimaliseerd voor een maximale recuperatie van hoge kwaliteit plasmide DNA.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
AcroPrep Advance Filter plate	Pall Corporation	PN 8175 (1 mL) or PN 8075 (350 µl)	3 μm glass fiber 0.2 μm Supor® membrane for clarification
AcroPrep Advance Filter Plate	Pall Corporation	PN 8132	for DNA Binding
Vacuum manifold	Pall Corporation	PN 5017
Vacuum pressure pump	Pall Corporation	PN 13157