Purification simplifiée d'ADN plasmidique de cultures procaryotes

Summary

Ce protocole est une alternative rentable pour les éclaircissements parallèles efficaces et de purification d'ADN plasmidique à partir de

Abstract

Nous décrivons le processus complet de plaques Advance AcroPrep filtre pour 96 préparations plasmidiques, à partir de la culture procaryotes et se terminant avec l'ADN de haute pureté. Basé sur plusieurs puits de filtration pour le dédouanement lysat bactérien et la purification de l'ADN, cette méthode crée un processus simplifié pour la préparation de plasmide. Filtre plaques contenant de la silice les médias peuvent être facilement traitées par filtration sous vide ou une centrifugeuse pour produire des quantités appréciables de l'ADN plasmidique. Les analyses quantitatives de déterminer l'ADN plasmide purifié est constamment de haute qualité avec DO moyenne _260/280 ratios de 1,97. Globalement, les rendements plasmide ADN offrent plus pur pour des applications en aval, telles que le séquençage et le clonage. Cette méthode simplifiée de l'aide de plaques Advance AcroPrep filtre permet un traitement manuel, semi-automatique ou entièrement automatique.

Protocol

1. Dégagement Lysat

1. Cultivez E. cultures coli transformée avec l'ADN plasmidique désiré dans assiettes creuses bien (1 ml de culture / puits) dans le bouillon Luria avec des antibiotiques appropriés nuit à 37 ° C avec agitation.
2. Pellet E. coli dans des plaques de culture à 5000 xg pendant 10 minutes, puis le surnageant décanter.
3. Resuspendre chaque pastille dans 100 uL tampon de resuspension (50 mM Tris-HCI, pH 8,0, EDTA 10 mM, 100 ug / ml de RNase A).
4. Ajouter 100 Lysis Buffer ul / puits (200 mM NaOH, 1% SDS) et agiter à l'aide Agitateur de plaque pendant 2 minutes.
5. Ajouter 100 tampon de neutralisation ul / puits (3,0 M acétate de potassium, pH 5,5) et agiter pendant 2 minutes.
6. Transfert lysat cellulaire à la plaque de lysat de clarification.
7. Plaque d'ADN Placez contraignante sur le dessus de 350 uL plaque de collection et le lieu dans le fond du collecteur à vide. Assemblez collecteur à vide (voir Figure 1).
8. Plaque de la Place des éclaircissements sur le dessus du lysat appareil à vide.
9. Appliquer vide à 10 po Hg (0,34 bar) et recueillir filtrat dans l'ADN plaque de fixation. Ne pas utiliser à vide supérieure à 12 po Hg. (0,41 bar).
10. Démonter collecteur à vide. Placer 2 ml plaque de collection des déchets dans le fond de l'appareil.

2. Liaison à l'ADN

1. Déplacer la plaque de fixation d'ADN au sommet du collecteur (voir Figure 2).
2. Ajouter 300 pi de tampon / puits reliure (6 M guanidine-HCl) et une pipette de haut en bas pour mélanger.
3. Appliquer le vide [~ 5 po Hg (0,17 bar) pour le vide lente] et jetez filtrat. L'ADN est maintenant lié à la membrane.
4. Laver avec 400 ul / puits de tampon de lavage (80% d'éthanol).
5. Appliquer le vide, puis jeter le filtrat. Jeter inutiles si vous utilisez deux plaques de collection ml ou de filtrage directement sur les déchets.
6. Répétez laver une fois.
7. Blot en bas de la plaque de filtre sur une serviette absorbante pour sécher.
8. Appliquer une fois de plus à vide pendant 5-10 minutes pour assurer l'élimination de l'alcool résiduel.
9. Blot en bas pour assurer l'élimination de gouttelettes d'éthanol.

3. Élution d'ADN

1. Ajouter 70 Elution Buffer ul / puits (10 mM Tris-HCI, pH 8,0, EDTA 1 mM). Si la concentration élevée d'ADN est désiré, le volume peut être réduit à 50 pl / puits, mais le rendement moyen total sera inférieur.
2. Incuber la plaque à température ambiante pendant une minute.
3. ADN purifié peut être élue par soit vide ou centrifugation.
4. Méthode sous vide: Placer la plaque de collecte propre (DNase, RNase) dans le collecteur d'aspiration. Placez la plaque de filtre sur le dessus du collecteur à vide, appliquer le vide à 15 po Hg (0,5 bar) pendant 1 minute jusqu'à ce que tous tampon d'élution a passé à travers la plaque de fixation d'ADN. Recueillir l'ADN purifié (voir Figure 3).
5. Méthode de centrifugation: plaque de purification de la Place de filtre sur le dessus de plaque de collection propre et centrifuger à 1000 xg pendant 5 minutes.

4. Analyses qualitative et quantitative

1. Mesure OD _260/280, calculer la concentration d'ADN purifié.
2. Effectuer une analyse sur gel d'agarose de l'ADNp purifiée.

5. Les résultats représentatifs

E. coli lysat clarifié par centrifugation traditionnelle et Pall AcroPrep Plaques Advance lysat éclaircissements Filtre a montré une réduction appréciable de débris de matériau de départ. (Figure 4).

L'ADN plasmidique à trois concentrations a été enrichi en tampon TE et passé à travers la plaque Advance AcroPrep clarification du lysat filtre. Une comparaison de la concentration de l'ADN plasmidique, pré-et post-filtration, montre ~ récupération de 100% (figure 5) à tous les trois concentrations.

Pour démontrer la récupération de l'ADN de clarifier E. coli lysat, l'ADN plasmidique a été enrichi en lysat brut et ensuite clarifié par filtration. L'ADN plasmidique mêmes a été ajouté à filtration après lysat cellulaire. L'électrophorèse a été réalisée sur des aliquotes de chaque échantillon (figure 6). Une seule bande claire d'intensité similaire à partir de chaque échantillon démontre peu ou pas de perte de l'ADN lors de l'étape de clarification de filtration à base.

Les cultures de E. coli contenant l'ADN plasmidique PCAT ont été purifiés à partir de E. coli lysats utilisant 350 uL de Pall et 1 ml liaison à l'ADN des plaques de filtration, ainsi que deux autres marques de 350 plaques d'ADN uL contraignant. Tous les purifications ont été effectuées comme spécifié dans le protocole recommandé par le fabricant. La plus forte concentration de l'ADN et le rendement total sont vus de Pall 1 ml Advance AcroPrep purification ADN filtre à plaques (figure 7 et tableau 2).

Bien Compétiteur W montre également la concentration d'ADN élevée (155 ng / uL), le rendement total de l'ADN est le plus bas (4,7 ug / puits) en raison du volume faible récupération, ~ 30 uL. Concurrent M a donné la plus faible concentration de l'ADN à 108 ng / uL avec un rendement total de 5,6 ug / puits.

Agarose gel de l'analyse d'ADN purifié à partir PCAT les trois plaques d'ADN différentes de liaison est montré dans la figure 8. Chaque volume de l'échantillon recueilli a été ajusté à 65 uL de corriger les différences de volume de récupération avant l'électrophorèse. Tous les échantillons montrent superenroulé ADN plasmidique, mais le rendement d'ADN de chacune des plaques de filtration varie.

La figure 9 montre l'ADN préparé tout est dans la forme et a superenroulé concentration similaire.

Figure 1. Assemblée du collecteur d'aspiration pour clarification du lysat.

Figure 2. Assemblée du collecteur d'aspiration pour fixation à l'ADN.

Figure 3. Assemblée des Collecteur à vide pour l'élution à vide.

Figure 4. Filtration simplifie la clarification de l'échantillon. Trois échantillons de 300 ul de lysat brut clarifiée par filtration sous vide (350 uL Advance AcroPrep clarification du lysat filtre à plaques) ou la centrifugation traditionnelle. OD ₃₂₀ mesurés avant et après clarification.

Figure 5. Le rétablissement complet de la ADNp après passage à travers la plaque Advance AcroPrep lysat éclaircissements filtre. 300 pi de tampon TE dopés avec PCAT à 25, 50 et 100 pg / mL. Concentration de l'ADN et la récupération calculée à partir de ₂₆₀ OD avant et après filtration, N = 2.

Figure 6. Récupération de l'ADN PCAT après clarification. Des quantités égales de pUC19 pointes en lysat avant ou après la clarification, puis diluée 1 à 10 dans du tampon TE. Chargée 2 pl / voies sur 1,2% gel d'agarose.

Figure 7. Rendement plus élevé d'ADN plasmidique par puits avec de l'ADN Pall Advance AcroPrep contraignante plaque filtrante que les plaques concurrent. PCAT le rendement d'ADN plasmidique (DO ₂₆₀₎ en utilisant des plaques de purification d'ADN indiquée avec 1 ml (Pall et M concurrent) ou 1,5 ml (Compétiteur W) culture de nuit de DH5a. Purification utilisant le protocole recommandé par le fabricant plaque. Les barres d'erreur indiquent l'erreur standard (n> 6).

Figure 8. Gel d'agarose analyse de l'ADN purifié sur plaque de PCAT ADN indique contraignant. 1,2% électrophorèse sur gel d'agarose des ADNp purifiée. Échantillons groupés par trois purifications séparées, éluat ajusté à 65 uL après purification, dilué à 1:10. Chargée 2 uL par voie.

Figure 9. La qualité et la récupération d'ADN pur similaires lorsque les méthodes de centrifugation ou sous vide sont utilisés pour la collecte d'électrophorèse sur gel d'agarose éluat final de l'ADNp purifiée. Protocole recommandé par le fabricant pour les plaques AcroPrep Filtre Advance a été suivie pour la purification ADNp. L'élution a été effectuée par centrifugation à 1000 xg pendant 5 minutes ou passer l'aspirateur avec 15 po Hg (0,5 bar) pendant 2 minutes.

Discussion

Nous décrivons une faciles, protocole simplifié de Plaques AcroPrep Filtre Advance qui offre plusieurs avantages. Cette méthode offre un maximum de rendements d'ADN plasmidique lorsqu'il est traité dans le manuel, semi-automatiques ou entièrement automatisés formats Advance AcroPrep. Un préfiltre intégré sur la plaque de dégagement lysat assure la filtration uniforme des échantillons, même ceux contenant des teneurs élevées de particules. La géométrie ainsi des résultats plus rapides dans les plaques, les taux de filtration plus uniforme à travers la plaque avec un minimum de volume de rétention, et la géométrie de la pointe de sortie fournit des flux directs d'échantillons dans la plaque du récepteur sans préoccupations de contamination croisée. Surtout, la membrane à haute capacité obligatoire dans la plaque de fixation d'ADN des plaques AcroPrep Filtre Advance est optimisé pour une récupération maximale de l'ADN plasmidique de haute qualité.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
AcroPrep Advance Filter plate	Pall Corporation	PN 8175 (1 mL) or PN 8075 (350 µl)	3 μm glass fiber 0.2 μm Supor® membrane for clarification
AcroPrep Advance Filter Plate	Pall Corporation	PN 8132	for DNA Binding
Vacuum manifold	Pall Corporation	PN 5017
Vacuum pressure pump	Pall Corporation	PN 13157