Purificación simplificada de ADN plásmido de las Culturas procariotas

Summary

Este protocolo es una alternativa rentable para la clarificación eficiente en paralelo y purificación del ADN plasmídico a partir de

Abstract

Se describe el proceso completo de placas adelantado AcroPrep de filtro para 96 ​​preparaciones de plásmidos, a partir de la cultura procariotas y terminando con el ADN de alta pureza. Sobre la base de múltiples pozos de filtración para el despacho de lisado bacteriano y purificación del ADN, este método crea un proceso simplificado para la preparación de plásmido. Placas de filtro que contiene los medios de comunicación a base de sílice pueden ser fácilmente transformados por filtración al vacío o centrifugación para producir cantidades apreciables de ADN del plásmido. Los análisis cuantitativos determinar el ADN de plásmido purificado es siempre de alta calidad con un promedio de OD _260/280 ratios de 1,97. En general, los rendimientos de plásmido ADN ofrecen más puro para aplicaciones posteriores, como la secuenciación y clonación. Este método simplificado de la utilización de placas AcroPrep Avance del filtro permite el procesamiento manual, semiautomático o completamente automático.

Protocol

1. Liquidación lisado

1. Crecer E. culturas coli transformadas con el ADN de plásmido deseado en profundidad placas (1 ml de la cultura / pocillo) en caldo Luria con los antibióticos apropiados durante la noche a 37 ° C con agitación.
2. Pellet E. coli en la placa de cultivo a 5.000 xg durante 10 minutos, luego decantar el sobrenadante.
3. Resuspender cada pellet en 100 l de búfer Resuspensión (50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 10 mM EDTA, 100 mg / ml RNasa A).
4. Añadir 100 tampón de lisis l / pocillo (200 mM NaOH, 1% SDS) y agitar con agitador de placas durante 2 minutos.
5. Añadir 100 l / pocillo de búfer neutralización (3,0 M de acetato de potasio, pH 5,5) y agitar durante 2 minutos.
6. Transferencia de lisado de células de la placa de lisado aclaración.
7. Coloque la placa de unión al ADN en la parte superior de la placa de recolección de 350 l, y el lugar en el fondo del colector de vacío. Montar colector de vacío (ver Figura 1).
8. Lisado lugar aclarar la placa en la parte superior de los aparatos de vacío.
9. Aplicar un vacío de 10 pulgadas de mercurio (0,34 bar) y recoger filtrado en la placa de unión al ADN. No utilice vacío superior a 12 mm Hg. (0,41 bar).
10. Desmontar colector de vacío. Coloque 2 ml de residuos recogida en la placa inferior del aparato.

2. De unión con ADN

1. Mover la placa de unión del ADN a la parte superior de la placa (ver Figura 2).
2. Añadir 300 l Buffer / Encuadernación y (6 M guanidina-HCl) y una pipeta de arriba a abajo para mezclar.
3. Aplicar un vacío [~ 5 mm Hg (0,17 bar) para el vacío lento] y desechar filtrado. ADN está ligado a la membrana.
4. Lavar con 400 l / pocillo de tampón de lavado (80% de etanol).
5. Aplicar un vacío, a continuación, descartar el filtrado. Deseche innecesaria si se usa 2 colecta ml o filtrando directamente a la basura.
6. Repetir el lavado una vez.
7. Blot parte inferior de la placa de filtro sobre una toalla absorbente para secar.
8. Aplicar un vacío, una vez más durante 5-10 minutos para asegurar la eliminación de los restos de alcohol.
9. Blot fondo para asegurar la eliminación de las gotas de etanol.

3. Elución del ADN

1. Añadir 70 l / y tampón de elución (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA). Si la mayor concentración de ADN que se desea, el volumen se reduce a 50 l / bien, pero el rendimiento total promedio será menor.
2. Incubar la placa a temperatura ambiente durante un minuto.
3. ADN purificado se eluye ya sea por vacío o centrifugación.
4. Método de vacío: Coloque la placa de recolección de limpia (DNasa, RNasa libre) en el colector de vacío. Colocar la placa de filtro en la parte superior del colector de vacío, aplicar vacío a 15 pulgadas de mercurio (0,5 bar) durante 1 minuto hasta que todos los buffer de elución ha pasado a través de la placa de unión al ADN. Recoger ADN purificado (ver Figura 3).
5. Método de centrifugación: Colocar la placa de purificación de filtro en la parte superior de la placa de recolección de limpia y se centrifuga a 1000 xg durante 5 minutos.

4. Los análisis cuantitativos y cualitativos

1. Medida de OD _260/280, calcular la concentración de ADN purificado.
2. Realizar un análisis en gel de agarosa de la pDNA purificada.

5. Resultados representante

E. coli lisado clarificado mediante centrifugación tradicional y Pall AcroPrep adelantado placas aclarar lisado filtro mostraron una reducción apreciable de los desechos de material de partida. (Figura 4).

ADN plásmido en tres concentraciones, se añadieron en buffer TE y pasa a través de la placa de Avance AcroPrep aclarar lisado filtro. Una comparación de la concentración de ADN plásmido, antes y después de la filtración, muestra a 100% de recuperación (Figura 5) en las tres concentraciones.

Para demostrar la recuperación de ADN de aclarar E. coli lisado ADN plásmido, se añadieron en lisado crudo y se clarificarán por filtración. El ADN del plásmido mismo se añadió a la filtración después de lisado celular. La electroforesis se realizó en alícuotas de cada muestra (Figura 6). Una banda única y clara de similar intensidad en cada ejemplo muestra poca o ninguna pérdida de ADN durante la fase de clarificación y filtración basados.

Los cultivos de E. coli que contiene el ADN del plásmido pCAT fueron purificados de E. coli lisados ​​con 350 l de Pall y 1 ml de ADN filtro de placas de unión, así como otras dos marcas de 350 placas de unión al ADN l. Todas las purificaciones se realizaron según lo especificado en el protocolo recomendado por el fabricante. La mayor concentración de ADN y la producción total se ven desde un Pall ml adelantado AcroPrep ADN de purificación de placas de filtro (Figura 7 y Tabla 2).

A pesar de la competencia W también muestra la concentración de ADN de alto (155 ng / l), el rendimiento total de ADN es la más baja (4,7 mg / así) debido a la recuperación del volumen bajo, aproximadamente 30 mL. Competidor M dio la menor concentración de ADN a 108 ng / l con un rendimiento total de 5,6 ug / pocillo.

Agarose análisis en gel de ADN purificado pCAT de las tres placas de unión al ADN diferente se muestra en la Figura 8. Cada volumen de la muestra recogida se ajustó a 65 l para corregir las diferencias en el volumen de recuperación antes de la electroforesis. Todas las muestras de ADN de plásmido superenrollado mostrar, pero varía el rendimiento de ADN de cada una de las placas de filtro.

La Figura 9 muestra que el ADN es preparado en forma de superenrollado y tiene una concentración similar.

Figura 1. Asamblea del colector de vacío para el Esclarecimiento lisado.

Figura 2. Asamblea del colector de vacío para la unión de ADN.

Figura 3. Asamblea del colector de vacío para la elución de vacío.

Figura 4. Filtración simplifica la aclaración de la muestra. Tres muestras de 300 l de lisado crudo aclaró por filtración al vacío (350 l Avance AcroPrep lisado placa aclaración filtro) o centrifugación tradicional. OD ₃₂₀ antes y después de la aclaración.

Figura 5. La recuperación total de pDNA tras el paso por adelantado AcroPrep placa de filtro lisado aclaración. 300 L de buffer TE enriquecida con pCAT a 25, 50 y 100 ug / mL. Concentración de ADN y la recuperación calculado a partir de ₂₆₀ OD antes y después de la filtración, N = 2.

Figura 6. La recuperación de ADN pCAT después de la clarificación. Igual cantidad de pUC19 añadidos en lisado antes o después de la aclaración, entonces se diluye 1 a 10 en buffer TE. Cargado 2 l / carril en el 1,2% en gel de agarosa.

Figura 7. Mayor rendimiento de ADN plasmídico por pocillo con ADN manto adelantado Acroprep placa de unión que las placas de filtro de la competencia. PCAT rendimiento de ADN plásmido (OD ₂₆₀₎ se indica con placas de purificación de ADN con 1 ml (Pall M y la competencia) o 1,5 mL (Competidor W) durante la noche de la cultura DH5a. Purificación mediante el protocolo recomendado por el fabricante de la placa. Las barras de error indican el error estándar (n> 6).

Figura 8. Agarosa análisis en gel de ADN purificado pCAT en la placa de unión al ADN indicó. Agarosa al 1,2% electroforesis en gel de la pDNA purificada. Muestras combinadas de las tres purificaciones por separado, eluido ajustado a 65 l después de la purificación, diluido 1:10. Cargado 2 l por carril.

Figura 9. La calidad y la recuperación de ADN puro similares cuando los métodos de centrifugación o vacío se utilizan para la final de la electroforesis en gel de agarosa colección eluido de la pDNA purificada. Protocolo recomendado por el fabricante para el Avance AcroPrep filtro de placas se ha seguido para la purificación pDNA. La elución se realizó por centrifugación a 1.000 xg durante 5 minutos o una aspiradora con 15 pulgadas de mercurio (0,5 bar) durante 2 minutos.

Discussion

Se describe un protocolo fácil, ágil de las placas de filtro AcroPrep anticipada que ofrece varias ventajas. Este método proporciona un rendimiento máximo de ADN plásmido cuando se procesan en formatos de avance manual, semiautomático o totalmente automatizado-AcroPrep. Un pre-filtro integrado en la placa de autorización lisado proporciona una filtración de las muestras, incluso las que contengan altos de partículas. La geometría y de los resultados de la placa más rápida, las tasas de filtración más uniforme a través de la placa con un mínimo de volumen de retención, y la geometría de la punta de salida proporciona un flujo directo de muestras en el plato receptor sin problemas de contaminación cruzada. Es importante destacar que la membrana de alta capacidad de unión de la placa de unión al ADN de AcroPrep adelantado placas de filtro está optimizado para una máxima recuperación de la calidad del ADN plásmido de alto.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
AcroPrep Advance Filter plate	Pall Corporation	PN 8175 (1 mL) or PN 8075 (350 µl)	3 μm glass fiber 0.2 μm Supor® membrane for clarification
AcroPrep Advance Filter Plate	Pall Corporation	PN 8132	for DNA Binding
Vacuum manifold	Pall Corporation	PN 5017
Vacuum pressure pump	Pall Corporation	PN 13157