Biology

Prokaryotic संस्कृति से प्लास्मिड डीएनए के सुव्यवस्थित शोधन

Published: January 5, 2011 doi: 10.3791/2407

Laura Pueschel¹, Hongshan Li¹, Matthew Hymes¹

Summary

इस प्रोटोकॉल कुशल समानांतर स्पष्टीकरण और से डीएनए प्लाज्मिड शुद्धि के लिए एक लागत प्रभावी विकल्प है

Abstract

हम AcroPrep 96 प्लाज्मिड की तैयारी के लिए अग्रिम फ़िल्टर प्लेट्स की पूरी प्रक्रिया का वर्णन, prokaryotic संस्कृति से शुरू और उच्च शुद्धता डीएनए के साथ समाप्त. बैक्टीरियल lysate निकासी और डीएनए की शुद्धि के लिए बहु छानने का काम अच्छी तरह के आधार पर, इस विधि प्लाज्मिड तैयारी के लिए एक सुव्यवस्थित प्रक्रिया बनाता है. फ़िल्टर प्लेटों सिलिका आधारित मीडिया युक्त आसानी से वैक्यूम निस्पंदन या प्लास्मिड डीएनए के एक प्रशंसनीय मात्रा उपज अपकेंद्रित्र द्वारा संसाधित किया जा सकता है. मात्रात्मक विश्लेषण निर्धारित शुद्ध प्लास्मिड डीएनए लगातार उच्च गुणवत्ता के 1.97 की औसत आयुध डिपो _260/280 अनुपात के साथ है . कुल मिलाकर, प्लाज्मिड पैदावार अधिक शुद्ध डीएनए अनुक्रमण और क्लोनिंग जैसे बहाव के अनुप्रयोगों, के लिए प्रदान करते हैं. AcroPrep अग्रिम फ़िल्टर प्लेट्स का उपयोग कर के इस सुव्यवस्थित विधि पुस्तिका, अर्द्ध स्वचालित या पूरी तरह से स्वचालित प्रसंस्करण के लिए अनुमति देता है.

Protocol

1. Lysate क्लीयरेंस

ई. आगे बढ़ें कोलाई गहरी अच्छी तरह प्लेटें में वांछित प्लास्मिड डीएनए (1 / संस्कृति में अच्छी तरह के एमएल) Luria शोरबा में उपयुक्त रातोंरात एंटीबायोटिक के साथ 37 ° सी झटकों के साथ के साथ बदल संस्कृतियों.
गोली संस्कृति की थाली में 10 मिनट के लिए 5,000 XG पर ई. कोलाई, तो छानना सतह पर तैरनेवाला.
100 μL Resuspension बफर (50 मिमी Tris - एचसीएल, 8.0 पीएच, 10 मिमी EDTA, 100 μg / एमएल एक RNase) में प्रत्येक गोली Resuspend.
100 μL / अच्छी तरह से lysis बफर (200 मिमी NaOH, 1% एसडीएस) जोड़ें और 2 मिनट के लिए थाली प्रकार के बरतन का उपयोग हिला.
100 निराकरण / μL अच्छी तरह से बफर (3.0 एम पोटेशियम एसीटेट, 5.5 पीएच) जोड़ें और 2 मिनट के लिए हिला.
सेल lysate स्थानांतरण स्पष्टीकरण थाली lysate.
350 μL संग्रह थाली और वैक्यूम कई गुना के नीचे में जगह के शीर्ष पर रखें डीएनए बाध्यकारी थाली. वैक्यूम कई गुना इकट्ठा (चित्रा 1 देखें).
वैक्यूम तंत्र के शीर्ष पर प्लेस lysate स्पष्टीकरण थाली.
10 अंदर पारा (0.34 पट्टी) वैक्यूम लागू करें और डीएनए बाध्यकारी थाली में छानना इकट्ठा. पारा अंदर 12 से अधिक निर्वात नहीं का उपयोग करें. (0.41 पट्टी).
वैक्यूम कई गुना जुदा. प्लेस तंत्र के तल में 2 एमएल अपशिष्ट संग्रह थाली.

2. डीएनए बाध्यकारी

कई गुना के शीर्ष करने के लिए डीएनए बाध्यकारी थाली ले जाएँ (चित्र 2 देखें).
300 μL / अच्छी तरह से बाध्यकारी बफर (6 एम Guanidine - एचसीएल) जोड़ें और ऊपर और विंदुक नीचे मिश्रण.
वैक्यूम लागू [~~ पारा अंदर 5 (0.17 बार) धीमी वैक्यूम के लिए] और छानना त्यागें. डीएनए अब झिल्ली के लिए बाध्य है.
धो बफर (80% इथेनॉल) के 400 μL / अच्छी तरह से धो.
निर्वात लागू, तो छानना त्यागें. 2 एमएल संग्रह प्लेट का उपयोग कर या सीधे फ़िल्टरिंग के लिए बेकार अगर अनावश्यक त्यागें.
एक बार धोने दोहराएँ.
ब्लाट के लिए सूखी शोषक तौलिया पर फ़िल्टर थाली के नीचे.
अवशिष्ट शराब के हटाने सुनिश्चित करने के 5-10 मिनट के लिए एक बार और अधिक निर्वात लागू करें.
नीचे ब्लाट इथेनॉल बूंदों को हटाने सुनिश्चित करने के.

3. डीएनए Elution

70 Elution / μL अच्छी तरह से बफर (10 मिमी Tris - एचसीएल, 8.0 पीएच, 1 मिमी EDTA) जोड़ें. यदि उच्च डीएनए एकाग्रता वांछित है, मात्रा 50 μL अच्छी तरह से / कम किया जा सकता है, लेकिन कुल औसत उपज कम हो जाएगा.
कमरे के तापमान पर एक मिनट के लिए थाली को सेते हैं.
शुद्ध डीएनए या तो निर्वात या centrifugation द्वारा eluted जा सकता है.
वैक्यूम विधि: निर्वात कई गुना प्लेस में साफ संग्रह थाली (DNase, RNase मुक्त). वैक्यूम कई गुना के शीर्ष पर फ़िल्टर थाली प्लेस, पारा (0.5 बार) के 1 मिनट के लिए अंदर 15 निर्वात लागू जब तक सभी elution बफर डीएनए बाध्यकारी थाली के माध्यम से पारित कर दिया गया है. शुद्ध डीएनए (चित्रा 3 देखें) ले लीजिए.
Centrifugation विधि: साफ संग्रह और 5 मिनट के लिए 1,000 XG पर थाली अपकेंद्रित्र के शीर्ष पर रखें शुद्धि फ़िल्टर थाली.

4. मात्रात्मक और गुणात्मक विश्लेषण

उपाय _260/280 आयुध डिपो, डीएनए शुद्ध की एकाग्रता की गणना .
शुद्ध pDNA के agarose जेल विश्लेषण प्रदर्शन.

5. प्रतिनिधि परिणाम

ई. कोलाई lysate पारंपरिक centrifugation और पाल AcroPrep अग्रिम lysate स्पष्टीकरण फ़िल्टर प्लेट्स का उपयोग स्पष्ट सामग्री शुरू करने से मलबे का प्रशंसनीय कमी देखी गई . (चित्रा 4).

तीन सांद्रता में प्लास्मिड डीएनए ते बफर में बालीदार था और AcroPrep अग्रिम lysate स्पष्टीकरण फ़िल्टर थाली के माध्यम से पारित कर दिया. प्लास्मिड डीएनए एकाग्रता की तुलना, पूर्व और बाद निस्पंदन, दिखाता है सभी तीन सांद्रता में 100% वसूली (चित्रा 5) ~.

स्पष्ट ई. से डीएनए की वसूली का प्रदर्शन कोलाई lysate, प्लास्मिड डीएनए कच्चे lysate में बालीदार था और फिर निस्पंदन द्वारा स्पष्ट है . एक ही डीएनए प्लाज्मिड सेल lysate निम्नलिखित छानने का काम करने के लिए जोड़ा गया है. वैद्युतकणसंचलन प्रत्येक नमूना (चित्रा 6) से aliquots पर प्रदर्शन किया गया था. एक एकल, प्रत्येक नमूने से इसी तरह की तीव्रता के स्पष्ट बैंड थोड़ा अगर निस्पंदन आधारित स्पष्टीकरण चरण के दौरान किसी भी डीएनए नुकसान को दर्शाता है.

ई की संस्कृतियों pCAT प्लाज्मिड डीएनए युक्त कोलाई ई. से शुद्ध थे कोलाई है पाल μL 350 और 1 एमएल डीएनए बाध्यकारी फ़िल्टर प्लेट्स, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से 350 μL डीएनए बाध्यकारी प्लेटों के दो अन्य ब्रांडों का उपयोग lysates है. सभी purifications निर्माता की सिफारिश प्रोटोकॉल में निर्दिष्ट के रूप में प्रदर्शन किया गया. उच्चतम डीएनए एकाग्रता और कुल उपज है पाल 1 एमएल AcroPrep अग्रिम डीएनए शुद्धि फ़िल्टर थाली (7 चित्रा और तालिका 2) से देखा जाता है.

हालांकि प्रतियोगी डब्ल्यू भी उच्च डीएनए एकाग्रता (155 एनजी / μL) से पता चलता है, कुल डीएनए उपज सबसे कम है (4.7 μg / अच्छी तरह से) कम वसूली की मात्रा के कारण, ~ 30 μL. प्रतियोगी एम 108 में डीएनए के सबसे कम एकाग्रता दिया एनजी / 5.6 μg / अच्छी तरह से कुल उपज के साथ μL.

अग्रवालose तीन अलग डीएनए बाध्यकारी प्लेटों से pCAT डीएनए शुद्ध जेल विश्लेषण 8 चित्र में दिखाया गया है. प्रत्येक एकत्र नमूना मात्रा 65 μL वैद्युतकणसंचलन के लिए पहले वसूली की मात्रा में अंतर के लिए सही करने के लिए समायोजित किया गया था. सभी नमूनों प्लास्मिड डीएनए supercoiled दिखाने के लिए, लेकिन फ़िल्टर प्लेट्स में से प्रत्येक से डीएनए उपज बदलता.

9 चित्रा से पता चलता है तैयार डीएनए supercoiled रूप में है और इसी तरह की एकाग्रता है.

चित्रा 1. Lysate स्पष्टीकरण के लिए वैक्यूम कई गुना की सभा.

चित्रा 2. विधानसभा के डीएनए बाध्यकारी के लिए वैक्यूम कई गुना.

चित्रा 3. वैक्यूम Elution के लिए वैक्यूम कई गुना की सभा.

चित्रा 4. निस्पंदन नमूना स्पष्टीकरण सरल है . कच्चे निर्वात (350 μL AcroPrep अग्रिम lysate स्पष्टीकरण फ़िल्टर थाली) छानने का काम या पारंपरिक centrifugation द्वारा स्पष्ट lysate के 300 μL की तीन प्रतियों के नमूने. आयुध डिपो ₃₂₀ में से पहले और बाद में स्पष्टीकरण मापा.

चित्रा 5. AcroPrep अग्रिम lysate स्पष्टीकरण फ़िल्टर थाली के माध्यम से पारित होने के बाद pDNA की पूरी वसूली. 300 μL ते बफर 50, 25, और 100 / μg एमएल pCAT के साथ बालीदार. डीएनए एकाग्रता और वसूली से पहले और छानने के बाद, एन ₌ 2 260 आयुध डिपो से गणना की है.

चित्रा 6. PCAT डीएनए के स्पष्टीकरण के बाद वसूली . पहले या स्पष्टीकरण के बाद lysate में बालीदार pUC19 के समान मात्रा में है, तब ते बफर में 10 से 1 पतला. 2 / 1.2% agarose जेल पर μL लेन भरा हुआ है.

7 चित्रा. हायर नक़ब Acroprep अग्रिम डीएनए प्रतियोगी प्लेटों से बाध्यकारी फ़िल्टर थाली के साथ अच्छी तरह से प्रति प्लास्मिड डीएनए उपज pCAT प्लाज्मिड डीएनए ₍₂₆₀ आयुध डिपो) उपज 1 (पाल और प्रतियोगी एम) एमएल या 1.5 (प्रतियोगी डब्ल्यू) एमएल रातोंरात संस्कृति के साथ संकेत डीएनए शुद्धि प्लेट का उपयोग कर . DH5α. थाली निर्माता सिफारिश प्रोटोकॉल का उपयोग शोधन. त्रुटि सलाखों मानक त्रुटि (n> 6) से संकेत मिलता है.

8 चित्रा. PCAT डीएनए के agarose जेल विश्लेषण संकेत डीएनए बाध्यकारी प्लेट पर शुद्ध है . 1.2 शुद्ध pDNA% agarose जेल वैद्युतकणसंचलन. तीन अलग purifications से जमा नमूने, eluate शुद्धि, पतला 1:10 के बाद 65 μL को समायोजित. 2 μL प्रति लेन भरा हुआ है.

9 चित्रा. गुणवत्ता और शुद्ध इसी तरह डीएनए जब अपकेंद्रित्र या वैक्यूम तरीकों अंतिम eluate शुद्ध pDNA का संग्रह agarose जेल वैद्युतकणसंचलन के लिए उपयोग किया जाता है की वसूली . निर्माता AcroPrep अग्रिम फ़िल्टर प्लेट्स के लिए सिफारिश प्रोटोकॉल pDNA शुद्धि के लिए पीछा किया गया था. Elution +१,००० XG अपकेंद्रित्र द्वारा 2 मिनट के लिए अंदर पारा (0.5 बार) 15 के साथ 5 मिनट या वैक्यूम के लिए प्रदर्शन किया था.

Discussion

हम एक सतही, AcroPrep अग्रिम फ़िल्टर प्लेट्स के सुव्यवस्थित प्रोटोकॉल है कि कई फायदे परमिट का वर्णन करता है. इस विधि अधिकतम प्लाज्मिड डीएनए पैदावार प्रदान करता है जब मैनुअल, अर्द्ध स्वचालित या पूरी तरह से स्वचालित AcroPrep अग्रिम स्वरूपों में संसाधित. Lysate निकासी की थाली पर एक एकीकृत prefilter नमूने, यहां तक कि particulates के उन युक्त उच्च स्तर के अनुरूप निस्पंदन प्रदान करता है. प्लेट परिणामों के तेजी से, अधिक वर्दी थाली भर न्यूनतम मात्रा पकड़ के साथ निस्पंदन दर में अच्छी तरह से ज्यामिति, और दुकान टिप ज्यामिति पार संदूषण की चिंताओं के बिना रिसीवर थाली में नमूने के प्रत्यक्ष प्रवाह प्रदान करता है. महत्वपूर्ण बात है, डीएनए AcroPrep अग्रिम फ़िल्टर प्लेट्स के बंधन थाली में उच्च बाध्यकारी क्षमता झिल्ली उच्च गुणवत्ता प्लास्मिड डीएनए की अधिकतम वसूली के लिए अनुकूलित है.

Disclosures

इस वीडियो लेख के लेखक पाल लाइफ साइंसेज, जो साधन और वीडियो और पाठ में विशेष रुप से प्रदर्शित अभिकर्मकों उत्पादन के कर्मचारी हैं.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
AcroPrep Advance Filter plate	Pall Corporation	PN 8175 (1 mL) or PN 8075 (350 µl)	3 μm glass fiber 0.2 μm Supor® membrane for clarification
AcroPrep Advance Filter Plate	Pall Corporation	PN 8132	for DNA Binding
Vacuum manifold	Pall Corporation	PN 5017
Vacuum pressure pump	Pall Corporation	PN 13157