Summary
Il est largement reconnu que les forces mécaniques dans le corps peut influencer la différenciation cellulaire et la prolifération. Nous présentons ici un protocole vidéo montrant l'utilisation d'un bioréacteur sur mesure pour livrer uniaxiale souche traction cyclique à des cellules souches cultivées sur des substrats flexibles micropatterned.
Abstract
Le rôle des forces mécaniques dans le développement et l'entretien des tissus biologiques est bien documenté, dont plusieurs phénomènes mécaniques réglementées telles que le remodelage osseux, l'hypertrophie musculaire, lisse et la plasticité des cellules musculaires. Cependant, les forces impliquées sont souvent extrêmement complexes et difficiles à surveiller et à contrôler in vivo. Afin de mieux étudier les effets des forces mécaniques sur les cellules, nous avons développé une méthode in vitro pour l'application de la déformation de traction uniaxiale cyclique pour cellules adhérentes en culture sur membranes élastiques. Cette méthode utilise un bioréacteur conçu sur mesure avec un moteur à rotor à cames système pour appliquer la force désirée. Nous présentons ici un protocole vidéo étape par étape, démontrant comment assembler les différents éléments de chaque «chambre d'étirement», y compris, dans ce cas, une membrane de silicone avec la topographie micropatterned d'orienter les cellules avec la direction de la souche. Nous décrivons également des procédures pour la stérilisation des chambres, l'ensemencement des cellules sur la membrane, la chambre de verrouillage dans le bioréacteur, et en ajustant les paramètres mécaniques (c. ampleur et le rythme de la souche). Les procédures décrites dans ce protocole particulier sont spécifiques pour l'ensemencement des cellules souches mésenchymateuses humaines sur des membranes en silicone avec 10 um canaux larges orientées parallèlement à la direction de la souche. Cependant, les méthodes et les matériaux présentés dans ce système sont suffisamment flexibles pour accommoder un certain nombre de variations sur ce thème: la vitesse de déformation, l'ampleur, la durée, type de cellule, la topographie de membrane, de revêtement de membrane, etc peuvent tous être adaptés à l'application souhaitée ou résultat. C'est une méthode robuste pour enquêter sur les effets des contraintes de traction uniaxiale appliquée à des cellules in vitro.
Protocol
Jour 0 - Stérilisation avant le jour de l'expérimentation
- Placez les matériaux dans baignoire en plastique et stériliser à l'alcool à 70% pendant 2 heures:
- Chambres
- Couvercles
- Cadres (tous les 3 pièces)
- Vis
- Joints en caoutchouc
- Forceps
- Ciseaux
- Clés hexagonales
- Nettoyez-le avec des membranes Aquet savon et l'eau distillée.
- Soniquer membranes dans l'alcool à 70% pendant 10 minutes.
- Placer les membranes de plastique propre dans des plats carrés. Si l'aide de membranes à motifs, s'assurer que le côté à motif est face (alcool de pulvérisation sur un côté de la membrane et de regarder pour le liquide de descendre les gorges).
- Laisser membranes couvert de l'alcool à 70% pendant 2 heures.
- Gants paquet dans du papier d'aluminium pour l'autoclavage demain matin.
- Faire 2% (poids / volume) une solution de gélatine (2g/100mL) dans de l'eau distillée pour autoclavage demain.
- Après la stérilisation 2 heures dans de l'alcool à 70%, placer tous les matériaux polymères et des membranes (non autoclavable matériaux) dans le capot d'UV nuit:
- Chambres
- Couvercles
- Cadres (tous les 3 pièces)
- Membranes
- Emballez les matériaux qui restent dans le sac autoclavable:
- Vis
- Joints en caoutchouc
- Forceps
- Ciseaux
- Clés hexagonales
Jour 1 - Assemblée des chambres étirer
- Pince autoclave, ciseaux, clés hexagonales, vis, joints, les gants, et la gélatine à l'aide petit autoclave à 240 ° F pendant 20 minutes au total
- Retirer les membranes de l'UV et le traiter avec plasma O 2 (côté à motifs vers le haut) pour ~ 1 minute.
- Dans le capot TC, couvrir la zone motifs des membranes plasma traité avec de la gélatine. Manteau 30 minutes sous les UV.
- Lavez chaque membrane avec du PBS 2X. Après le lavage 2e laisser certains PBS sur les membranes pour les garder glissante, pour faciliter le montage dans les chambres. (Faut aussi utiliser cette PBS pour lubrifier les joints pour faciliter le montage).
- Assemblez les membranes dans des chambres (porter des gants lors du montage autoclave)
- Connectez les deux pièces principales de l'image en utilisant une seule vis.
- Retournez le cadre de cours et le lieu d'une membrane sur le haut de sorte que les faces latérales revêtues de gélatine vers le cadre (la zone doit être modelée dans le centre).
- Fixez la membrane sur le châssis à l'aide d'un joint de chaque côté.
- Appuyer les joints de l'aide douceur, même pression, afin de ne pas déchirer la membrane.
- Fixez cadre assemblé à T-bar.
- Retournez le châssis et le placer dans la chambre à l'envers. Arrière UV du cadre et de la membrane pendant 30 minutes
- Retournez le cadre nouveau, et vis dans les chambres (pas de changement pour la chambre de contrôle, mais pour la chambre de s'étirer, nécessité d'utiliser deux vis pour fixer l'embout de l'image au fond de la chambre, et la nécessité de retirer la vis unique qui est tenant les deux pièces de la carcasse ensemble). Face avant UV pendant 30 min. Assurez-vous que les membranes sont complètement secs avant de procéder à l'étape suivante, ou bien la solution de cellules peut glisser pendant le semis.
- Cellules de semence. Espace de 1 = Zone assiette de 3 membranes, donc utiliser 1 / 3 d'une plaque confluentes par membrane. Utiliser 1 ml de solution par cellule à membrane. Pas plus que 1,5 ml sera difficile de garder solution sur. Mettez solution cellulaire que sur la zone à motifs, et d'utiliser la pipette pour répandre la solution inverse. Couvrez et laissez chambres attachent cellules pendant 30 minutes RT dans la hotte.
- Déplacer les chambres de l'incubateur et laissez cellules attachent pour l'heure une de plus. Soyez très prudent déplacer les chambres d'éviter de laisser glisser solution cellulaire! Les cellules dans cette chambre sera ruinée si la solution tombe à ce point.
- Retour à la chambre de capot et ajouter 20 ml de milieu.
- Placez les chambres à l'alcool nettoyé baignoire qui est recouvert de papier d'aluminium (également pulvérisé avec de l'alcool). Déplacer chambres d'étirer incubateur (10% de CO 2).
- Chambres sécurisées dans la machine stretch. Laissez d'autres cellules attachent la nuit, et commencer à étirer le lendemain. (Remarque: lors de la mise chambres dans la machine étirer, n'oubliez pas de verrouiller la machine dans la position «zéro» avant de placer les chambres, puis serrez la bande élastique autour de l'engrenage Ne pas oublier de déverrouiller les engrenages avant de commencer la machine.).
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Discussion
Banes et al. D'abord rapporté l'utilisation d'un système de stimulation mécanique des cellules in vitro en utilisant un substrat en élastomère souple pour fournir la force mécanique des cellules 1. Depuis ce temps, beaucoup de variations sur cette conception ont été conçues et utilisées. Plusieurs systèmes de stretch mécanique sont disponibles commercialement sous le nom de "Flexercell" (Flexcell International Corp), tandis que certains laboratoires utilisent des dispositifs sur-mesure. Dans ce protocole vidéo que nous avons décrit la configuration et l'utilisation d'un tel dispositif dans notre laboratoire.
La «machine à étirer" sur-mesure décrite dans ce protocole a été utilisé dans diverses études pour étudier les effets de la déformation cyclique uniaxiale sur différents types cellulaires 2,3. Cette machine est un appareil polyvalent avec plusieurs paramètres réglables qui peuvent être utilisés pour une variété d'études de déformation mécanique. La configuration décrite dans ce document représentent une méthode unique et robuste pour offrir contrainte cyclique uniaxiale à cellules adhérentes en culture.
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Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Fungizone | Reagent | Lonza Inc. | 17-836R | aliquot is 250 ug/mL, 100x, stored in -20C. |
| Kanamycin | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15160-054 | 50 ug/mL final concentration. Store stock solution at 10 mg/ml in -20C. |
| Gentamicin | Reagent | Lonza Inc. | 17-518Z | 50 ug/mL final concentration. Store 1000x stocks at 50 mg/mL in -20C. |
| Pen/Strep | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | 1% final. (Also available from other companies) |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11966-025 | |
| Notes on media:These uniaxial stretch experiments are prone to contamination due to the complexity of bioreactor setup. To combat this, we have tried various combinations of antibiotics and antifungal agents. The 1% fungizone usually necessary, along with a combination of antibiotics. Either use a Pen/Strep combination, OR use a combination of Kanamycin and Gentamicin (but DO NOT try using a combination/cocktail of three or more antibiotics together as it may lead to resistant mutant bacteria, and may also be detrimental to the cells). | ||||
References
- Banes, A. J., Gilbert, J., Taylor, D., Monbureau, O. A new vacuum-operated stress-providing instrument that applies static or variable duration cyclic tension or compression to cells in vitro. J Cell Sci. 75, 35-42 (1985).
- Park, J. S., Chu, J. S., Cheng, C., Chen, F., Chen, D., Li, S. Differential effects of equiaxial and uniaxial strain on mesenchymal stem cells. Biotechnol. Bioeng. 88, 359-368 (2004).
- Kurpinski, K., Chu, J., Hashi, C., Li, S. Anisotropic mechanosensing by mesenchymal stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 103, 16095-16100 (2006).
