Summary
それは広く体内に機械的な力が細胞の分化と増殖に影響を与えることができることが理解される。ここでは、柔軟なマイクロパターン基板上に培養した細胞を食い止めるために一軸周期引っ張り歪みを配信するための特注のバイオリアクターの使用方法を示すビデオプロトコルを提示する。
Abstract
生体組織の開発と保守における機械的な力の役割は、骨リモデリング、筋肥大、および平滑筋細胞の可塑性など、いくつかの機械的に安定化の現象を含め、文書化されています。しかし、関与する力がしばしば監視し、生体内で制御することが非常に複雑で困難です。より良い細胞に対する機械的な力の影響を調べるために、私たちは弾性膜上で培養した接着細胞に一軸周期引っ張り歪みを印加するためのin vitro法で開発している。このメソッドは、所望の力を適用するには電動カムローターシステムによるカスタム設計のバイオリアクターを利用しています。ここでは、歪みの方向に向い細胞へのマイクロパターン形状を持つシリコン膜を、この場合は、を含む、各"ストレッチチャンバー"のさまざまなコンポーネントを、組み立てる方法を示すステップバイステップのビデオのプロトコルを提示する。我々はまた、チャンバを滅菌メンブレン上に細胞を播種、バイオリアクターにチャンバーをラッチし、機械的なパラメータ（つまり、大きさとひずみの速度）を調整するための手順について説明します。この特定のプロトコルで説明した手順は、歪みの方向に対して平行に配向さ10μm幅のチャネルをシリコン膜上にヒト間葉系幹細胞を播種するための固有のものです。しかし、このシステムで提示方法および材料は、このテーマのバリエーションの数を収容するのに十分な柔軟性があります：ひずみ速度、大きさ、持続時間、細胞の種類、膜の地形、膜のコーティングなどはすべて、目的のアプリケーションに合わせることができますか成果。これは、in vitroで細胞に適用される一軸引張ひずみの影響を調査するための堅牢な方法です。
Protocol
0日目 - 実験の日前に滅菌
- プラスチック浴槽に材料を入れ、2時間、70％アルコールで消毒。
- チェンバース
- 蓋
- フレーム（全3枚）
- ネジ
- ゴム製のガスケット
- 鉗子
- はさみ
- 六角レンチ
- Aquet石鹸と蒸留水でメンブレンをクリーニング。
- 10分間70％アルコールで膜を超音波処理してください。
- プラスチック製の四角い皿にきれいな膜を置きます。パターニングされた膜を使用している場合、パターン化された側は表向き（スプレー溝を下に実行するために液体の膜と時計の片面にアルコール）であることを確認してください。
- 2時間70％アルコールで覆われた膜を残す。
- 明日の朝オートクレーブ用アルミ箔へのパッケージの手袋。
- 明日のオートクレーブ用蒸留水で2％（重量/体積）ゼラチン溶液（2g/100mL）を作る。
- 70％アルコールで2時間滅菌した後、一晩UV用フードにすべての高分子材料と膜（非オートクレーブ材）に置きます：
- チェンバース
- 蓋
- フレーム（全3枚）
- メンブレン
- オートクレーブ可能な袋に残りの材料をパック。
- ネジ
- ゴム製のガスケット
- 鉗子
- はさみ
- 六角レンチ
1日目 - ストレッチチャンバーの組立
- オートクレーブ鉗子、はさみ、20分、合計で240 ° Fで小さなオートクレーブを使用して六角レンチ、ネジ、ガスケット、手袋、およびゼラチン
- UVからメンブレンを取り出して、約1分間O 2プラズマ（上にパターン側）で扱います。
- TCのフードでは、ゼラチンとプラズマ処理膜のパターン化された領域をカバー。 UV下分間コート30。
- PBS 2Xで各メンブレンを洗浄する。第二洗浄した後、チャンバーに簡単に組み立てのために、それらが滑りやすい保つために膜にいくつかのPBSを残す。 （も簡単に組立用ガスケットの潤滑にこのPBSを使用する必要があります）。
- チャンバー内に膜をアセンブル（組み立て時のオートクレーブ手袋を着用）
- 1本のネジを使用してフレームの2つの主要部分を接続します。
- フレームを裏返し、フレームに向かってゼラチンでコーティングされた側面が（パターン化された領域が中心になるはず）ように上に膜を置きます。
- 各側のガスケットを使用してフレームに膜を固定します。
- そのような膜をリッピングすることはなく、穏やかな、均等に力を使って、でガスケットを押してください。
- T -バーに組み立てフレームを取り付けます。
- 逆さまにチャンバー内にフレームと場所を反転します。 30分間フレームと膜のUV背面側
- 再びフレームを反転し、チャンバーにネジ（制御室用の変更なし、しかしストレッチチャンバー用、チャンバーの下部にフレームのエンドピースを接続する2本のネジを使用する必要が、となる1本のネジを削除する必要があります。 ）一緒にフレームの2つの部分を保持する。 30分間UV正面側。膜は、次の手順に進む前に、完全に乾いてから、または他の細胞溶液は種まき時にオフに滑りができることを確認してください。
- 種子の細胞。 3膜の1枚=エリアの面積は、その膜ごとコンフルエントプレートの1 / 3を使用してください。膜セルあたりの溶液1 mLを使用してください。 1.5mlのか以上は解決策を続けることは困難になります。のみパターン化された領域に細胞溶液を入れ、そして周りのソリューションを広めるためにピペットチップを使用してください。チャンバーをカバーし、細胞がフードで30分をRTに接続することができます。
- インキュベーターにチャンバーを移動し、細胞が1以上の時間のために添付してみましょう。細胞溶液をオフスリップさせることを避けるためにチャンバーを移動するには十分注意してください！解決策は、この時点で落ちる場合、そのチャンバー内の細胞が台無しにされます。
- フードにチャンバーを戻すと20 mLのメディアを追加。
- アルミ箔（また、アルコールをスプレー）で覆われてアルコール洗浄浴槽の場所室。インキュベーター（10％CO 2）を延長するためにチャンバーを移動します。
- ストレッチマシンにチャンバーを固定します。細胞はさらに一晩接続し、次の日にストレッチを始めましょう。 （ 注 ：ストレッチマシンに室を置くとき、チャンバーを配置する前に"ゼロ"の位置にマシンをロックしてから、ギアまわりのラバーバンドを締めるために覚えてマシンを起動する前にギアのロックを解除することを忘れないでください。）。
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Discussion
ベインズら。最初はセル1に機械的な力を提供する柔軟なエラストマー材を使用してin vitroでの細胞の機械的な刺激のためのシステムを使用することを報告した。この時以来、この設計上の多くのバリエーションが考案され、利用されています。いくつかのラボは、特注の装置を使用しながら、いくつかのメカニカルストレッチシステムでは、名前"Flexercell"（Flexcellインターナショナル株式会社）の下で市販されている。このビデオプロトコルでは、我々の研究室でそのようなデバイスのセットアップと使用方法を記載している。
このプロトコルに示されている特注の"ストレッチマシンは、"異なる細胞型2,3の一軸周期的ひずみの影響を調べるために様々な研究で使用されています。このマシンは、機械的な歪みの様々な研究に使用できるいくつかの調整可能なパラメータを持つ多目的な装置である。架空のセットアップは、文化での付着細胞への一軸循環株を提供するためのユニークかつ堅牢な方法を表します。
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Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Fungizone | Reagent | Lonza Inc. | 17-836R | aliquot is 250 ug/mL, 100x, stored in -20C. |
| Kanamycin | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15160-054 | 50 ug/mL final concentration. Store stock solution at 10 mg/ml in -20C. |
| Gentamicin | Reagent | Lonza Inc. | 17-518Z | 50 ug/mL final concentration. Store 1000x stocks at 50 mg/mL in -20C. |
| Pen/Strep | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | 1% final. (Also available from other companies) |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11966-025 | |
| Notes on media:These uniaxial stretch experiments are prone to contamination due to the complexity of bioreactor setup. To combat this, we have tried various combinations of antibiotics and antifungal agents. The 1% fungizone usually necessary, along with a combination of antibiotics. Either use a Pen/Strep combination, OR use a combination of Kanamycin and Gentamicin (but DO NOT try using a combination/cocktail of three or more antibiotics together as it may lead to resistant mutant bacteria, and may also be detrimental to the cells). | ||||
References
- Banes, A. J., Gilbert, J., Taylor, D., Monbureau, O. A new vacuum-operated stress-providing instrument that applies static or variable duration cyclic tension or compression to cells in vitro. J Cell Sci. 75, 35-42 (1985).
- Park, J. S., Chu, J. S., Cheng, C., Chen, F., Chen, D., Li, S. Differential effects of equiaxial and uniaxial strain on mesenchymal stem cells. Biotechnol. Bioeng. 88, 359-368 (2004).
- Kurpinski, K., Chu, J., Hashi, C., Li, S. Anisotropic mechanosensing by mesenchymal stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 103, 16095-16100 (2006).
