Summary
En general, se entiende que las fuerzas mecánicas en el cuerpo puede influir en la diferenciación y proliferación celular. Aquí se presenta un protocolo de vídeo que demuestra el uso de un biorreactor a medida para la entrega de tensión uniaxial de tracción cíclica a las células madre cultivadas en substratos flexibles micropatterned.
Abstract
El papel de las fuerzas mecánicas en el desarrollo y mantenimiento de los tejidos biológicos está bien documentado, entre ellos varios fenómenos mecánicos regulados, como la remodelación ósea, la hipertrofia muscular, y la plasticidad de células musculares lisas. Sin embargo, las fuerzas implicadas son a menudo extremadamente complejos y difíciles de supervisar y controlar en vivo. Para investigar mejor los efectos de las fuerzas mecánicas de las células, hemos desarrollado un método in vitro para la aplicación de tensión uniaxial de tracción cíclica de las células adherentes cultivadas en membranas elásticas. Este método utiliza un biorreactor de diseño personalizado con un motor de leva-rotor del sistema para aplicar la fuerza deseada. Aquí se presenta un protocolo de vídeo paso a paso que muestra cómo ensamblar los distintos componentes de cada una "cámara de estiramiento", incluyendo, en este caso, una membrana de silicona con la topografía micropatterned para orientar a las células con la dirección de la cepa. También se describen los procedimientos para la esterilización de las cámaras, la siembra de las células en la membrana, con retención de la cámara en el biorreactor, y el ajuste de los parámetros mecánicos (es decir, la magnitud y la velocidad de deformación). Los procedimientos descritos en este protocolo particular son específicos para la siembra de células madre mesenquimales humanas en las membranas de silicona con 10 canales de micras de ancho orientada paralela a la dirección de la tensión. Sin embargo, los métodos y materiales que se presentan en este sistema son lo suficientemente flexibles para dar cabida a una serie de variaciones sobre este tema: la velocidad de deformación, magnitud, duración, tipo de célula, la topografía de membrana, la membrana de recubrimiento, etc todo se puede adaptar a la aplicación deseada o resultado. Este es un método robusto para la investigación de los efectos de la deformación por tracción uniaxial aplicada a las células in vitro.
Protocol
0 día - La esterilización antes del día de experimento
- Ponga los materiales en la tina de plástico y esterilizar con alcohol al 70% durante 2 horas:
- Cámaras
- Tapas
- Marcos (las 3 piezas)
- Tornillos
- Las juntas de goma
- Fórceps
- Tijeras
- Llaves hexagonales
- Membranas limpia con agua y jabón Aquet destilada.
- Sonicar membranas en alcohol al 70% durante 10 minutos.
- Coloque las membranas de plástico limpia en platos cuadrados. Si se utiliza membranas de dibujos, asegúrese de que el lado estampado quede hacia arriba (alcohol spray en un lado de la membrana y velar por el líquido a correr por los surcos).
- Deja membranas cubiertos en el 70% de alcohol durante 2 horas.
- Guantes de paquete en papel de aluminio para autoclave mañana por la mañana.
- Haga 2% (peso / volumen) solución de gelatina (2g/100mL) en agua destilada para el autoclave mañana.
- Después de la esterilización de dos horas en el 70% de alcohol, coloque todos los materiales polímeros y las membranas (no autoclavable materiales) en la capilla de UV durante la noche:
- Cámaras
- Tapas
- Marcos (las 3 piezas)
- Membranas
- Paquete de materiales sobrantes en una bolsa de autoclave:
- Tornillos
- Las juntas de goma
- Fórceps
- Tijeras
- Llaves hexagonales
Día 1 - La Asamblea de las cámaras se extienden
- Autoclave pinzas, tijeras, llaves hexagonales, tornillos, juntas, guantes, y la gelatina con autoclave pequeño 240 ° F durante 20 minutos en total
- Quitar las membranas de los rayos UV y tratamiento con plasma de O 2 (lado del patrón hacia arriba) de aproximadamente 1 minuto.
- En la campana TC, cubrir el área de modelado de las membranas de plasma tratado con gelatina. Escudo de 30 minutos bajo los rayos UV.
- Lavar cada membrana con PBS 2X. Después del lavado segunda, dejar un poco de PBS en las membranas de mantener más deslizantes, para facilitar el montaje en las cámaras. (También debe utilizar este PBS para lubricar las juntas para facilitar el montaje).
- Montar las membranas en las cámaras (use guantes de autoclave durante el montaje)
- Conecte las dos piezas principales de la estructura con un solo tornillo.
- Da la vuelta al cuadro una y colocar una membrana en la parte superior para que las caras laterales recubiertos de gelatina hacia el bastidor (el área de modelado debe estar en el centro).
- Asegurar la membrana al marco mediante una junta en cada lado.
- Presione las juntas de, con suave, aunque la presión, a fin de no rasgar la membrana.
- Adjuntar marco se reunieron para T-bar.
- Voltear el marco y el lugar dentro de la cámara al revés. Parte posterior del bastidor UV y de la membrana durante 30 minutos
- Voltear el marco de nuevo, y el tornillo en las cámaras (sin cambio de cámara de control, pero para la cámara de estiramiento, la necesidad de utilizar dos tornillos para sujetar la pieza final de la trama en la parte inferior de la cámara, y la necesidad de quitar el tornillo que se la celebración de las dos piezas de la estructura en conjunto). Parte frontal UV durante 30 minutos. Asegúrese de que las membranas estén completamente secas antes de proceder al siguiente paso, o de lo contrario la solución de células pueden deslizarse durante la siembra.
- Las células de las semillas. Área de 1 = Área placa de 3 membranas, por lo que el uso 1 / 3 de una placa confluente por membrana. Use 1 ml de solución de células por la membrana. No más que 1,5 ml, será difícil mantener la solución en. Poner la solución única celda en el área de modelado, y el uso de la pipeta para extender la solución de todo. Cubrir las cámaras y dejar que las células conectar durante 30 minutos RT en el capó.
- Mover las cámaras a la incubadora y dejar que las células de conectar por 1 hora más. Tener mucho cuidado en movimiento de las cámaras para evitar que la solución de células resbale! Las células en la cámara se arruinará si la solución se cae en este momento.
- Volver a la campana de la cámara y agregar 20 ml de medio.
- Cámaras en lugar de alcohol limpia tina que se cubre con papel de aluminio (también rociados con alcohol). Mover las cámaras para estirar la incubadora (10% CO 2).
- Cámaras de seguro en la máquina de estiramiento. Deje que las células más adjuntar toda la noche, y empezar a estirar al día siguiente. (Nota: la hora de poner cámaras en la máquina de estirar, recuerde que debe cerrar la máquina en la posición "cero" antes de colocar las cámaras, y luego ajuste la banda de goma alrededor de los engranajes No te olvides de desbloquear los engranajes antes de iniciar la máquina.).
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Discussion
Banes et al. informó por primera vez el uso de un sistema de estimulación mecánica de las células in vitro mediante el uso de un sustrato de elastómero flexible para proporcionar la fuerza mecánica a las células 1. Desde entonces, muchas variaciones en este diseño han sido concebidos y utilizados. Varios sistemas de estiramiento mecánico están disponibles comercialmente bajo el nombre de "Flexercell" (FlexCell International Corp.), mientras que algunos laboratorios utilizan costumbre-construido dispositivos. En este protocolo de vídeo se ha descrito la configuración y el uso de un dispositivo de este tipo en nuestro laboratorio.
La costumbre-construido "máquina de estirar" representado en este protocolo se ha utilizado en diversos estudios para investigar los efectos de la tensión cíclica uniaxial en diferentes tipos de células 2,3. Esta máquina es un aparato versátil, con varios parámetros ajustables que se pueden utilizar para una variedad de estudios de la tensión mecánica. La configuración descritos en este documento representa un método único y robusto para la entrega de la tensión cíclica uniaxial de células adherentes en la cultura.
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Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Fungizone | Reagent | Lonza Inc. | 17-836R | aliquot is 250 ug/mL, 100x, stored in -20C. |
| Kanamycin | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15160-054 | 50 ug/mL final concentration. Store stock solution at 10 mg/ml in -20C. |
| Gentamicin | Reagent | Lonza Inc. | 17-518Z | 50 ug/mL final concentration. Store 1000x stocks at 50 mg/mL in -20C. |
| Pen/Strep | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | 1% final. (Also available from other companies) |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11966-025 | |
| Notes on media:These uniaxial stretch experiments are prone to contamination due to the complexity of bioreactor setup. To combat this, we have tried various combinations of antibiotics and antifungal agents. The 1% fungizone usually necessary, along with a combination of antibiotics. Either use a Pen/Strep combination, OR use a combination of Kanamycin and Gentamicin (but DO NOT try using a combination/cocktail of three or more antibiotics together as it may lead to resistant mutant bacteria, and may also be detrimental to the cells). | ||||
References
- Banes, A. J., Gilbert, J., Taylor, D., Monbureau, O. A new vacuum-operated stress-providing instrument that applies static or variable duration cyclic tension or compression to cells in vitro. J Cell Sci. 75, 35-42 (1985).
- Park, J. S., Chu, J. S., Cheng, C., Chen, F., Chen, D., Li, S. Differential effects of equiaxial and uniaxial strain on mesenchymal stem cells. Biotechnol. Bioeng. 88, 359-368 (2004).
- Kurpinski, K., Chu, J., Hashi, C., Li, S. Anisotropic mechanosensing by mesenchymal stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 103, 16095-16100 (2006).
