Summary
Bu yaygın vücut mekanik kuvvetleri, hücre farklılaşması ve proliferasyonu etkisi olduğu anlaşılmaktadır. Burada esnek micropatterned yüzeylerde kültüre kök hücre, tek eksenli döngüsel çekme gerilme sağlamak için özel olarak inşa edilmiş biyoreaktör kullanımını gösteren bir video protokolü mevcut.
Abstract
Biyolojik dokuların gelişimi ve bakım mekanik güçlerin rolü iyi kemik remodeling, kas hipertrofisi ve düz kas hücre plastisite gibi çeşitli mekanik düzenlenir fenomenler de dahil olmak üzere, belgelenmiştir. Ancak, yer alan güçlerin çoğu in vivo olarak izlemek ve kontrol etmek için son derece karmaşık ve zor. Hücrelerin mekanik güçlerin etkilerini araştırmak için, biz, tek eksenli döngüsel çekme gerilme elastik membranlar kültüre yapışık hücrelere uygulamak için in vitro yöntem geliştirmiştir. Bu yöntem, istenilen güç uygulamak için motorlu bir kam-rotor sistemi ile özel tasarlanmış biyoreaktör kullanır. Burada yönlendirmek suşu yönü ile hücreleri micropatterned topografya ile bir silikon membran, bu durumda da dahil olmak üzere her "streç odasına" çeşitli bileşenleri, nasıl monte edildiğini gösteren bir adım-adım video protokolü mevcut. Ayrıca sterilizasyon odaları, membran tohum hücreleri, biyoreaktör odasına kilitlenen ve mekanik parametreleri (yani büyüklüğü ve gerilme oranı) ayarlamak için prosedürler açıklanmaktadır. Bu özellikle, protokolde belirtilen prosedürler gerilme yönüne paralel yönelik 10 mikron genişliğinde kanallar silikon membranlar üzerine insan mezenkimal kök hücreleri tohumlama için özeldir. Ancak, yöntem ve bu sistem içinde sunulan bu tema üzerine çeşitlemeler sayısını karşılamak için yeterince esnek: gerinim hızı, büyüklüğü, süresi, hücre tipi, membran topografyası, membran kaplama, vb istediğiniz uygulamayı ya da uyarlanabilir. sonucu. Bu, in vitro hücrelere uygulanan tek eksenli çekme gerilme etkilerinin araştırılması için sağlam bir yöntem.
Protocol
Gün 0 - deney gün önce Sterilizasyon
- Plastik küvetin içine malzeme koyun ve 2 saat boyunca% 70 alkol ile sterilize edin:
- Chambers
- Kapaklar
- Çerçeveler (3 adet)
- Vidalar
- Lastik contalar
- Forseps
- Makas
- Hex anahtarı
- Aquet sabun ve distile su ile temizleyin membranlar.
- 10 dakika boyunca% 70 alkol membranlar sonikasyon.
- Temiz zarında plastik kare kaplarına yerleştirin. Eğer desenli membranlar kullanarak desenli yan (membran bir yüzüne sprey alkol ve oluklar çalıştırmak için sıvı izlemek) karşı karşıya olduğundan emin olun.
- 2 saat boyunca% 70 alkol kaplamalı membranlar bırakın.
- Yarın sabah otoklav için alüminyum folyo içine Paket eldivenler.
- Yarın otoklav için distile su,% 2 (ağırlık / hacim) jelatin solüsyonu (2g/100mL) olun.
- 2 saat Sterilizasyon sonrasında% 70 alkol tüm polimer malzemeler ve membranlar (otoklav olmayan malzemelerin), gece UV kaput içine yerleştirin:
- Chambers
- Kapaklar
- Çerçeveler (3 adet)
- Membranlar
- Otoklavlanabilir torbaya kalan malzemeleri Paketi:
- Vidalar
- Lastik contalar
- Forseps
- Makas
- Hex anahtarı
1. Gün - streç odaları Meclisi
- Otoklav forseps, makas, toplam 20 dakika için 240 ° F küçük otoklav kullanarak altıgen anahtarı, vida, conta, eldiven ve jelatin
- UV membranlar çıkarın ve yaklaşık 1 dakika boyunca O 2 plazma (kadar desenli tarafı) ile tedavi.
- TC kaput, jelatin ile plazma tedavi membranlar desenli alanı kapsayacak. Kat 30 dakika boyunca UV altında.
- Membran, PBS 2X ile her yıkayın. 2. yıkamadan sonra, odalarına kolay montaj için, onları kaygan tutmak için bazı PBS membranlar üzerinde bırakın. (Aynı zamanda kolay montaj için contalar yağlamak için bu PBS kullanmalı mıyım).
- (Montaj sırasında otoklavlanmış eldiven giymek) odalarına membranlar birleştirin
- Bir tek vida kullanarak çerçevenin iki ana parça takın.
- Çerçeveye çevirin ve çerçevenin doğru jelatin kaplı yan yüzleri (desenli alan merkezi olmalıdır), böylece üstüne bir zar yerleştirin.
- Membran, her tarafında bir conta kullanarak çerçeveye sabitleyin.
- Nazik kullanarak, conta basın, hatta basınç, böylece membran rip değil.
- T-bar monte çerçeve takın.
- Odasına çerçevesi ve yeri ters çevirin. 30 dakika, çerçevesi ve membran UV arka tarafı
- Çerçeveyi yeniden çevirin ve odaları içine vida (kontrol odası için değişiklik yok, ama streç odası için odasının alt çerçevenin sonuna parça takmak için iki vida kullanmak gerekir, ve bir tek vida kaldırmak gerekir ) bir arada tutan çerçevenin iki adet. 30 dakika UV ön tarafı. Membranlar sonraki adıma geçmeden önce TAMAMEN kuru, ya da başka hücre çözümü tohumlama sırasında kayarak emin olun.
- Tohum hücreleri. 3 membranların 1 tabak = Alan Bölgesi, 1 / 3 'konfluent plaka başına bir membran kullanın. Membran hücre başına çözüm 1 mL kullanın. 1.5mL 'den herhangi bir çözüm tutmak zor olacaktır. Hücre çözümü sadece desenli alan üzerine koyun ve çözüm etrafında yaymak için pipet kullanın. Odaları Kapak ve hücreler 30 dakika kaputu RT eklemek izin.
- Inkübatör odaları Taşı ve hücreler 1 saat daha eklemek sağlar. Odaları hareket hücre çözümü kayarak izin önlemek için çok dikkatli olun! Çözümü bu noktada düşerse o odasında hücreler harap olacaktır.
- Kaput odasına dönün ve 20 ml medya ekleyebilirsiniz.
- Alkol temizlenir küvet koyun odaları alüminyum folyo (alkol ile püskürtülür) ile kaplıdır. Inkübatör (% 10 CO 2) streç odaları taşıyın.
- Streç makinenin içine Güvenli odaları. Hücreleri daha gecede takın ve ertesi gün streç başlatmak. (Not: streç makinenin içine odaları koyarken, "sıfır" konumunda odaları yerleştirmeden önce makine kilidi, ve daha sonra vites etrafındaki lastik bant sıkın unutmayın makineyi çalıştırmadan önce vites kilidini açmak için ihmal etmeyin.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Banes ve ark. ilk hücreleri 1 mekanik güç sağlamak için esnek bir elastomerik substrat kullanılarak, in vitro hücre mekanik uyarılması için bir sistem kullanımı bildirdi . O tarihten bu yana, bu tasarım çok varyasyon tasarlanmış ve kullanılmıştır. Bazı laboratuvarlar, özel olarak inşa edilmiş cihazlar kullanırken Çeşitli mekanik gerilme sistemleri, "Flexercell" (Tıkla FlexCell International Corp) adı altında ticari mevcuttur. Bu video protokolde böyle bir cihazın kurulumu ve kullanımı bizim laboratuvar tarif var.
Bu protokol tasvir özel olarak inşa edilen "streç makinesi" farklı hücre tipleri 2,3 eksenli döngüsel suşu etkilerini araştırmak amacıyla çeşitli çalışmalarda kullanılmıştır. Bu makine, çeşitli mekanik gerilme çalışmalar için kullanılan birkaç ayarlanabilir parametreleri ile çok yönlü bir aparat. Burada tasvir kurulum yapışık hücrelere kültür eksenli siklik yüklenme sağlamak için benzersiz ve güçlü bir yöntem temsil eder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Fungizone | Reagent | Lonza Inc. | 17-836R | aliquot is 250 ug/mL, 100x, stored in -20C. |
| Kanamycin | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15160-054 | 50 ug/mL final concentration. Store stock solution at 10 mg/ml in -20C. |
| Gentamicin | Reagent | Lonza Inc. | 17-518Z | 50 ug/mL final concentration. Store 1000x stocks at 50 mg/mL in -20C. |
| Pen/Strep | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | 1% final. (Also available from other companies) |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11966-025 | |
| Notes on media:These uniaxial stretch experiments are prone to contamination due to the complexity of bioreactor setup. To combat this, we have tried various combinations of antibiotics and antifungal agents. The 1% fungizone usually necessary, along with a combination of antibiotics. Either use a Pen/Strep combination, OR use a combination of Kanamycin and Gentamicin (but DO NOT try using a combination/cocktail of three or more antibiotics together as it may lead to resistant mutant bacteria, and may also be detrimental to the cells). | ||||
References
- Banes, A. J., Gilbert, J., Taylor, D., Monbureau, O. A new vacuum-operated stress-providing instrument that applies static or variable duration cyclic tension or compression to cells in vitro. J Cell Sci. 75, 35-42 (1985).
- Park, J. S., Chu, J. S., Cheng, C., Chen, F., Chen, D., Li, S. Differential effects of equiaxial and uniaxial strain on mesenchymal stem cells. Biotechnol. Bioeng. 88, 359-368 (2004).
- Kurpinski, K., Chu, J., Hashi, C., Li, S. Anisotropic mechanosensing by mesenchymal stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 103, 16095-16100 (2006).
