建立小鼠胚胎神经干细胞培养神经球含量

Summary

这个视频协议演示应用程序的神经球实验胚胎每天14鼠脑的神经节金榜，神经干细胞的分离和扩张。

Abstract

在哺乳类动物中，干细胞作为一种未分化的细胞来源，动物的寿命期间保持在不同组织和器官的细胞起源和重建。他们有可能取代细胞在衰老过程中或在损伤和疾病的的过程中丢失。神经干细胞（NS​​Cs）的存在，最初是由雷诺和Weiss（1992），在成年哺乳动物的中枢神经系统使用一种新型的无血清培养系统，神经球检测（NSA）（中枢神经系统）。使用这个实验中，它也是可行的隔离和扩大来自胚胎中枢神经系统的不同地区的神经干细胞。这些在体外培养扩增神经干细胞是多能的，可以引起中枢神经系统的三个主要类型的细胞。虽然NSA似乎相对简单的执行，注意这里展示的程序是必需的，以实现可靠的和一致的结果。实际上该视频演示NSA的产生和扩大神经干细胞从胚胎一天14鼠脑组织和提供技术细节，因此可以实现重复性的神经球文化。过程包括收获，E14小鼠胚胎脑显微切割收获神经节金榜，在国科会中期收获的组织分解，从而获得单细胞悬液，并终于在NSA的文化电镀细胞。经过5-7天的文化，由此产生的初级神经球传代，以进一步扩大，为今后的实验中的神经干细胞的数量。

Protocol

1。基本设置，然后再进行剥离：

1. 完成国科会培养基的准备适当的音量NeuroCult NSC基础培养基和NeuroCult NSC增殖辅料，分别在9:1的比例混合。
2. 在37℃水浴介质预热。
3. 冷战的HEPES缓冲的最低限度的基本介质与高浓度抗生素（10％）（HEM）准备剥离和清洗的目的。另外，国科会与抗生素补充培养基，也可能被用于此目的。
4. 25-30毫升含抗生素的冷HEM分装到无菌的胚胎收集50 mL管。
5. 几个10厘米塑料培养皿需要清扫期间举行的胚胎和大脑，还举行解剖组织。
6. 消毒用的手术工具，需要删除的胚胎（大剪刀，小尖剪刀，大钳，小弯钳）或胚胎脑夹层（小镊子，弯细钳，45 °角的精细镊子，小剪刀）玻璃珠的灭菌器在250 ° C或其他可用高压灭菌方法。
7. 解剖镜下用70％酒精擦拭和层流或PC2罩内设立。

2。收获E14，小鼠大脑和显微解剖：

1. 交配孕鼠一时间天麻醉14 ^次妊娠的机构批准的动物协议。
2. 颈椎脱位执行，以确保动物不遭受的痛苦和悲伤。
3. 麻醉鼠标是奠定其吸水纸巾的背面，腹部是用70％乙醇冲洗，消毒面积。
4. 在腹部的皮肤是掌握使用大钳，大剪刀切割，然后在皮肤底层筋膜暴露腹腔和子宫角。
5. 用小镊子和剪刀的子宫被删除，转移到50 ml锥形管中冷下摆。
6. 子宫组织转移到引擎盖和足够量的新鲜无菌冷下摆一次或两次，然后冲洗，以消除可能的污染物，如血液和头发。
7. 子宫组织，然后转移到一个培养皿中含有冷HEM10厘米。
8. 子宫角用小弯钳和剪刀打开，胚胎被转移到一个新10厘米的菜，其中包含冷HEM。
9. 胚胎的头是分开的脊髓型颈椎病水平，并转移到另一个培养皿中含有冷HEM。
10. 在解剖显微镜下去除颅骨脑转移培养皿。
11. 从尾侧用细弯钳，使首脑背侧朝上元首举行。采用微型剪刀，是第一个横向切上面的眼睛，然后继续在中线从额头对的后脑勺。确保穿过皮肤和颅骨，不要损害底层的大脑。
12. 大脑是从头骨，推动在一个落后的议案，用弯钳切条的边缘。此过程继续，直到所有的大脑是从头骨中删除。
13. 大脑是稳定的使用，使背侧朝上，然后使用microscissors降息是通过每个从嗅球半球半球揭露节后金榜背面的皮质执行的弯钳举行。
14. 一方面使用弯钳和在其他的45 °直角钳，皮质切断皮瓣的传播和解剖，神经节金榜。
15. 解剖组织是放置在一个无菌10厘米的培养皿中，此过程重复进行，直到所有的大脑已经微解剖。
16. 收集组织块用1毫升的NSC培养基在1毫升枪头，转移到15 mL离心管中。
17. 组织彻底分离，但轻轻按下枪头，试管底部，吹打暂停向上和向下。这种方式的团块被分解成单个细胞。移液是使银河系一样悬挂，是取得了3-4倍。然后，暂停允许定居1-2分钟，使沉淀的非游离团块。
18. 几乎整个细胞悬液转移到其他管，然后再1毫升的NSC培养基添加到剩余的团块和单细胞分离所述。
19. 池，离心管的内容为5分钟，在室温下，在700rpm（110克）。
20. 上清液真空断下降到实际的颗粒，并在1毫升完成国科会培养基悬浮细胞。
21. 介质轻轻吸管和向下有一个均匀的单细胞悬液。
22. 10μL的细胞悬液混合90μL台盼蓝进行细胞计数。
23. 最后，这些细胞是镀在国科会与20ng / mL表皮生长因子（EGF）在完全培养基2 × 10 ⁵细胞/ mL密度。用于T25，T75和T175烧瓶40毫升20毫升5毫升培养基。
24. 在5-7天，在37 ° C的5％，在培养箱_CO 2培养时形成神经球。在6-7天，球应措施150-200微米之间，将准备的亚文化（通过）。

3。胚胎神经干细胞传代和扩展：

1. 当神经球准备的亚文化（150-200微米，直径），悬浮领域的介质是从烧瓶中删除，放置在一个适当大小的无菌组织培养试管，离心5分钟700转（110克）室温。
2. 上清被丢弃和重悬于1毫升的0.05％胰蛋白酶EDTA的领域。
3. 细胞悬液，然后在37℃水浴2-3分钟中孵育，然后同等体积的大豆胰蛋白酶抑制剂是用来阻止胰蛋白酶的活性。
4. 细胞悬液轻轻吸管，以确保已完全灭活，胰蛋白酶。
5. 细胞悬液，离心5分钟700转（110克）。然后，取上清液被删除，在1毫升完成国科会培养基悬浮细胞。
6. 10μL的细胞悬液混合90μL台盼蓝进行细胞计数。
7. 在完成国科会与20ng / mL的EGF在一个适当大小的组织培养瓶中补充的中等浓度的^5X10 4细胞/ mL接种于细胞。用于T25，T75和T175烧瓶40毫升20毫升5毫升培养基。
8. 中学神经球形成5-7天，在37 ° C的5％，在培养箱_CO 2培养时。

4。代表性的成果：

初级胚胎NSC文化，将成为大多数细胞肥厚和附加到组织培养皿后，电镀。虽然多数细胞死亡后2-3天，或分化，增殖细胞，使细胞脱离基板（图1）的小集群。文化的第一个48小时的大型球状聚合形成的，不应该被误认为是首要领域。总结形成主要取决于在文化的碎片和非游离组织团块金额。真正的神经球是相明亮，变得更加大小的增加（图2）球形。小microspikes上可行的和健康的领域（图3）的外表面出现。经过5-7天，球必须是圆的，但不板结;和测量直径150至200微米。如果神经球是允许的增长过大（后9-10天在文化），他们可能会形成聚集体或颜色较暗，在球体的中心，因为细胞死亡（见视频）。大神经球，最终可能开始分化原位 （附加基板和向外围迁移）。这也是难以解离大神经球传代培养他们。

图1。小学E14，NSC电镀后3天的文化。箭头显示神经干细胞的增殖集群。原放大; 20X

图2。小学E14，NSC电镀后第7天的文化。原始的放大倍率; 10倍

图3。电镀后的通道之一，E14神经球5天。注意在外围的领域微尖峰（箭头）。原放大; 20X

Discussion

神经球检测神经干细胞，因为它的简单性和可重复性^1-5隔离和扩张的首选方法。这个实验是一种未分化的中枢神经系统的前体细胞，这可能是在体外和体内研究的大型代的宝贵工具。应该强调的，可以从无论是真正的神经干细胞和更受限制的祖细胞生成神经球。因此，计算神经球的形成频率，简单地高估了真正的神经干细胞在任何特定的^神经细胞人口6。要估计真正的神经干细胞的频率，这是强烈建议使用的神经细胞集落形成细胞分析（N CFCA），并已^为此 7开发。

为了有一个一致的高品质的E14，神经干细胞的神经干文化，我们建议：

1. 前的准备开始收获的胚胎需要的物品。
2. 为了保持在寒冷的HEM或整个解剖基础NSC培养基中的胚胎。
3. 为了尽可能快地执行清扫（1 h内），作为组织变得柔软，粘随着时间的推移，可能难以剖析。
4. 不要让太多的领域成长。通常情况下，他们应子培养5-7天，每一个球体的大小而定。
5. 要trypsinize在2-3分钟150-200微米大小的球。留下超过3分钟的胰蛋白酶，导致细胞受损和球体形成效率会降低，细胞往往会附加培养皿和分化。

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
NeuroCult NSC Basal Medium	Medium	Stem Cell Technologies	05700
NeuroCult NSC Proliferation Supplements	Medium supplement	Stem Cell Technologies	05701
%0.05 trypsin-EDTA	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	25300-062
Soybean trypsin inhibitor	Reagent	Sigma-Aldrich	T6522
Pen/Strep	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	15140-122
*MEM	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	41500-018	HEM component
*HEPES	Reagent	Sigma-Aldrich	H4034	HEM component
*Distilled water	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	15230-147
Cell strainer	Sieve	BD Biosciences	352340
T25 flask	Culture ware	Nalge Nunc international	136196
T80 flask	Culture ware	Nalge Nunc international	178905
15 ml tubes	Culture ware	BD Biosciences	352096
50 ml tubes	Culture ware	BD Biosciences	352070
Fine curved forceps	Surgical tools	Fine Science Tools	11251‐35
Small fine forceps	Surgical tools	Fine Science Tools	11272‐30
Small forceps	Surgical tools	Fine Science Tools	11050‐10
Fine scissors	Surgical tools	World Precision Instruments, Inc.	500216
EGF	Growth factor	R&D Systems	2028-EG
b-FGF	Growth factor	R&D Systems	3139-FB
Heparin	Growth factor	Sigma-Aldrich	H4784	Reconstituted in PBS
*To make HEM, mix 1×10L packet of MEM and160ml of 1M HEPES and bring the volume to 8.75 L using distilled water. Set the final PH to 7.4 and store it at 4°C.