Summary
Deze video toont protocol de toepassing van de neurosphere test voor de isolatie en de uitbreiding van neurale stamcellen van het ganglionisch eminenties van embryonale dag 14-hersenen van muizen.
Abstract
In zoogdieren, stamcellen fungeert als een bron van ongedifferentieerde cellen naar cel ontstaan en vernieuwing in verschillende weefsels en organen te behouden gedurende de levensduur van het dier. Ze kunnen eventueel vervangen door cellen die verloren zijn gegaan in het verouderingsproces en bij het proces van letsel en ziekte. Het bestaan van neurale stamcellen (NSCs) werd voor het eerst beschreven door Reynolds en Weiss (1992) in de volwassen centrale zenuwstelsel (CZS) met behulp van een nieuw serum-vrije cultuur systeem, de neurosphere assay (NSA). Met behulp van deze test, is het ook mogelijk te isoleren en uit te breiden NSCs uit verschillende regio's van de embryonale CZS. Deze in vitro uitgebreid NSCs zijn multipotente en kunnen aanleiding geven tot de drie belangrijkste celtypes van het centrale zenuwstelsel. Terwijl de NSA lijkt relatief eenvoudig uit te voeren, de aandacht voor de procedures aangetoond hier is nodig om betrouwbare en consistente resultaten te bereiken. Deze video toont op een praktische NSA te genereren en te NSCs uit te breiden van embryonale dag 14-mouse hersenweefsel en zorgt voor technische details, zodat men kan bereiken reproduceerbaar neurosphere culturen. De procedure omvat het oogsten E14 muizenembryo's, de hersenen microdissectie het ganglion eminenties, dissociatie van het geoogste weefsel in NSC medium oogst naar een enkele celsuspensie te krijgen, en uiteindelijk plating cellen in NSA cultuur. Na 5-7 dagen in cultuur, zijn de resulterende primaire neurospheres gepasseerd verder uit te breiden het nummer van de NSCs voor toekomstige experimenten.
Protocol
1. Basic Set Up Alvorens Dissection:
- Geschikt volume van complete NSC medium wordt bereid door het mengen van NeuroCult NSC basismedium en NeuroCult NSC proliferatieverdrag Supplementen op een 09:01 verhouding, respectievelijk.
- Het medium wordt opgewarmd in een 37 ° C waterbad.
- Koude HEPES-gebufferd minimum essentieel medium (HEM) met een hoge concentratie van antibiotica (10%) is voorbereid voor dissectie en wassen doel. Als alternatief kan NSC basaal medium met antibiotica suppletie ook gebruikt worden voor dit doel.
- 25-30 ml koud HEM met antibiotica wordt verdeeld in steriele 50 ml buizen voor het innen van de embryo's.
- Verschillende 10cm plastic petrischaaltjes zijn nodig om de embryo's en de hersenen houden tijdens dissectie en ook om ontleed weefsel vast te houden.
- De chirurgische instrumenten, die nodig zijn om de embryo's (grote schaar, kleine puntige schaar, pincet grote, kleine gebogen tangen) of voor de embryonale hersenen dissectie (kleine tang, gebogen fijne tang, 45 ° gebogen fijne tang, en een klein schaartje) te verwijderen zijn gesteriliseerd met behulp van glaskraal sterilisator bij 250 ° C of andere beschikbare methoden autoclaaf.
- Dissectie microscoop is afgenomen met 70% alcohol en het opzetten van in een laminaire flow of PC2 kap.
2. Oogsten E14 Mouse Hersenen en Micro-dissectie:
- Een tijd geschatte zwangere muis is verdoofd op dag 14 e van de zwangerschap op basis van een institutionele goedgekeurd dier protocol.
- Cervicale dislocatie wordt uitgevoerd om te zorgen dat de dieren geen pijn en verdriet lijden.
- De verdoofde muis wordt gelegd op zijn rug op een absorberend tissue papier, en de buik wordt gespoeld met 70% ethanol om het gebied te steriliseren.
- De huid over de buik is begrepen het gebruik van een grote tang, en dan de huid en de onderliggende fascia wordt gesneden met grote schaar van de buikholte en de baarmoederhoorns bloot te leggen.
- De baarmoeders worden verwijderd met een kleine tang en schaar en zijn overgebracht naar een 50-ml conische buis-bevattende koud HEM.
- De baarmoeder weefsels worden overgebracht naar de motorkap en vervolgens een of twee keer gespoeld met voldoende volume van verse koude steriele HEM om mogelijke verontreinigingen zoals bloed en haren te verwijderen.
- De baarmoeder weefsel worden vervolgens overgebracht naar een 10cm petrischaal met koud HEM.
- De baarmoeder hoorns worden geopend met behulp van kleine gebogen pincet en een schaar en de embryo's worden overgebracht naar een nieuw 10cm schotel, die koud HEM bevat.
- De hoofden van de embryo's worden gescheiden bij het cervicale ruggenmerg niveau en overgebracht naar een ander Petri schaaltje met koud HEM.
- De petrischaal is overgedragen krachtens een dissectiemicroscoop naar de hersenen uit de schedel.
- De koppen worden gehouden met een fijne gebogen pincet uit de caudale zijde om zo de dorsale zijde van het hoofd rechtop staan. Met behulp van micro-schaar, wordt eerst een horizontale snede gemaakt boven de ogen en daarna voortgezet in de middellijn van het voorhoofd naar de achterkant van het hoofd. Zorg ervoor dat u dwars door de huid en de schedel en niet op de onderliggende hersenschade.
- De hersenen is verwijderd uit de schedel door op de randen van de snede in een achterwaartse beweging met behulp van de gebogen pincet. Deze procedure wordt voortgezet totdat alle hersenen worden verwijderd uit de schedels.
- Het brein is stabiel gebleven met behulp van de gebogen pincet, zodat de dorsale zijde naar boven en dan geconfronteerd met behulp van microscissors een snede is uitgevoerd door de cortex van elke hemisfeer zich uitstrekt van de olfactorische lampen aan de achterkant van de hemisfeer aan het ganglionisch eminenties bloot te leggen.
- Met behulp van de gebogen tang in de ene hand en de 45 ° gebogen pincet in de andere, zijn de cut flappen van de cortex te verspreiden en het ganglionisch eminenties worden ontleed uit.
- De ontleed weefsel wordt geplaatst in een steriele petrischaal 10cm, en deze procedure wordt herhaald totdat alle hersenen zijn micro-ontleed.
- Tissue stukken zijn verzameld met behulp van 1 ml van NSC medium in een 1 ml pipet tip en overgebracht naar een 15 ml centrifugebuis.
- Weefsel wordt vervolgens gedissocieerd grondig, maar voorzichtig door het indrukken van de pipet tip om de bodem van de buis en pipetteren de schorsing op en neer. Op deze manier de klompen worden opgesplitst in afzonderlijke cellen. Pipetteren is uitgevoerd 3-4 keer zodat er een melkachtige als suspensie is ontstaan. Vervolgens wordt de suspensie mag zo genoegen nemen met 1-2 minuten als de niet-gesplitste klonten precipitaten.
- Bijna de gehele celsuspensie wordt overgebracht naar de andere buis en dan nog 1 mL van NSC medium wordt toegevoegd aan de resterende klompen en gedissocieerde naar een cel, zoals beschreven.
- De inhoud van de buizen worden samengevoegd en gecentrifugeerd gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur, bij 700rpm (110g).
- Het supernatant wordt gestofzuigd af naar de werkelijke pellet, en de cellen worden opnieuw gesuspendeerd in 1 ml van complete NSC medium.
- Het medium is voorzichtig gepipetteerd op en neer omhebben een homogene enkele celsuspensie.
- 10 pi van de celsuspensie wordt gemengd met 90 pi van trypan blauw om een celgetal te voeren.
- Ten slotte worden de cellen uitgeplaat op de dichtheid van 2x10 5 cellen / ml in volledig NSC medium aangevuld met 20ng / mL epidermale groeifactor (EGF). 5 ml medium wordt gebruikt voor T25, 20 ml voor T75 en 40 ml voor T175 kolven.
- Neurospheres worden gevormd in 5-7 dagen toen geïncubeerd bij 37 ° C in een bevochtigde incubator met 5% CO 2. In 6-7 dagen, moeten de bollen te meten tussen de 150 tot 200 micron en zullen klaar zijn om een subcultuur (passage).
3. Passage en uitbreiding van de embryonale NSC:
- Wanneer de neurospheres klaar zijn voor subcultuur (150-200 micrometer in diameter), is het medium met onderbroken bollen verwijderd van de kolven, geplaatst in een geschikte grootte steriele cultuur buis, en gecentrifugeerd bij 700 tpm (110 g) gedurende 5 min bij kamertemperatuur.
- Het supernatant wordt verwijderd en de sferen zijn geresuspendeerd in 1 ml van 0,05% trypsine-EDTA.
- De celsuspensie wordt vervolgens geïncubeerd in een 37 ° C waterbad gedurende 2-3 minuten, dan een gelijk volume van soja trypsine-remmer wordt gebruikt om de trypsine-activiteit te stoppen.
- De celsuspensie wordt zachtjes gepipetteerd op en neer om ervoor te zorgen dat de trypsine volledig is geïnactiveerd.
- De celsuspensie wordt gecentrifugeerd bij 700 tpm (110 g) gedurende 5 minuten. Vervolgens wordt het supernatant verwijderd en de cellen worden opnieuw gesuspendeerd in 1 ml van complete NSC medium.
- 10 pi van de celsuspensie wordt gemengd met 90 pi van trypan blauw om een celgetal te voeren.
- De cellen worden uitgeplaat bij een concentratie van 5x10 4 cellen / ml in volledig NSC medium aangevuld met 20ng / mL EFG in een geschikte grootte weefselkweek kolf. 5 ml medium wordt gebruikt voor T25, 20 ml voor T75 en 40 ml voor T175 kolven.
- Secundaire neurospheres worden gevormd in 5-7 dagen toen geïncubeerd bij 37 ° C in een bevochtigde incubator met 5% CO 2.
4. Representatieve resultaten:
Bij primaire embryonale NSC cultuur, zal de meerderheid van de cellen hypertrofische en hechten aan de weefselkweek gerechten op plating. Terwijl de meerderheid van de cellen zal ofwel sterven of te onderscheiden, na 2-3 dagen, proliferatieve cellen te maken kleine clusters van cellen die los van het substraat (figuur 1). Vorming van grote bolvormige aggregaten in de eerste 48-uren van de cultuur moet niet worden verward met de primaire bollen. Totale formatie hangt vooral af van de bedragen van puin en niet-gesplitste weefsel klonten in de cultuur. Echte neurospheres zijn fase helder en meer sferische als grootte toeneemt (Figuur 2). Kleine microspikes verschijnt op de buitenkant van levensvatbare en gezonde bollen (figuur 3). Na 5-7 dagen, moet de sferen rond zijn, maar niet verdicht, en moet tussen de 150 en 200 micrometer in diameter te meten. Als neurospheres kunnen groeien te groot (na 9-10 dagen in cultuur), kunnen ze vormen aggregaten of donker van kleur omdat van celdood in het midden van de bollen (zie video). Grote neurospheres kan uiteindelijk beginnen te differentiëren in situ (vastmaken aan de ondergrond en het migreren van de richting van de periferie). Het is ook moeilijk om grote neurospheres dissociëren en subcultuur ze.
Figuur 1. Primaire E14 NSC cultuur 3 dagen na de plating. Pijlen geven de prolifererende clusters van NSC. Originele vergroting; 20x
Figuur 2. Primaire E14 NSC cultuur 7 dagen na plating. Originele vergroting; 10x
Figuur 3. Passage een E14 neurospheres 5 dagen na plating. Let op de micro-spikes (pijlen) aan de rand van de bollen. Originele Vergroting; 20x
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De neurosphere assay is de methode van keuze voor de isolatie en de uitbreiding van neurale stamcellen 1-5 vanwege de eenvoud en reproduceerbaarheid. Deze test is een waardevol instrument voor grootschalige opwekking van ongedifferentieerde CNS voorloper cellen, die kunnen worden gebruikt voor zowel in vitro als in vivo studies. Benadrukt moet worden dat neurospheres kunnen worden gegenereerd uit zowel de bonafide neurale stamcellen en meer beperkt voorlopers. Daarom is de berekening van de neurosphere vorming frequentie gewoon overschat het aantal bonafide NSCs in een bepaalde neurale celpopulatie 6. Voor een schatting van de frequentie van de bonafide NSCs, is het sterk aanbevolen om de Neural Colony Forming Cell Assay (N-CBVC), dat is ontwikkeld voor dit doel 7 te gebruiken.
Om een constante hoge kwaliteit neurosphere cultuur van de E14 NSCs, raden wij aan:
- Om de benodigde onderdelen voor te bereiden voordat u begint met de embryo's te oogsten.
- Om de embryo's in koud HEM of basale NSC medium heel dissectie.
- Voor het uitvoeren van dissectie zo snel mogelijk (binnen 1 uur), zoals weefsel wordt zacht en kleverig na verloop van tijd en kan moeilijk te ontleden.
- Niet te laten groeien de bol te veel. Meestal moeten ze worden sub-gekweekt elke 5-7 dagen afhankelijk van de grootte van de bollen.
- Om trypsinize de bollen op de grootte van 150-200 um voor 2-3 minuten. Het verlaten van trypsine voor meer dan 3 minuten veroorzaakt schade aan de cellen en de bol vormen minder efficiënt wordt en de cellen zullen de neiging om de cultuur gerechten bevestigen en te differentiëren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door financiering van de Overstreet Foundation.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| NeuroCult NSC Basal Medium | Medium | Stem Cell Technologies | 05700 | |
| NeuroCult NSC Proliferation Supplements | Medium supplement | Stem Cell Technologies | 05701 | |
| %0.05 trypsin-EDTA | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 25300-062 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Reagent | Sigma-Aldrich | T6522 | |
| Pen/Strep | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| *MEM | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 41500-018 | HEM component |
| *HEPES | Reagent | Sigma-Aldrich | H4034 | HEM component |
| *Distilled water | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15230-147 | |
| Cell strainer | Sieve | BD Biosciences | 352340 | |
| T25 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 136196 | |
| T80 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 178905 | |
| 15 ml tubes | Culture ware | BD Biosciences | 352096 | |
| 50 ml tubes | Culture ware | BD Biosciences | 352070 | |
| Fine curved forceps | Surgical tools | Fine Science Tools | 11251‐35 | |
| Small fine forceps | Surgical tools | Fine Science Tools | 11272‐30 | |
| Small forceps | Surgical tools | Fine Science Tools | 11050‐10 | |
| Fine scissors | Surgical tools | World Precision Instruments, Inc. | 500216 | |
| EGF | Growth factor | R&D Systems | 2028-EG | |
| b-FGF | Growth factor | R&D Systems | 3139-FB | |
| Heparin | Growth factor | Sigma-Aldrich | H4784 | Reconstituted in PBS |
*To make HEM, mix 1×10L packet of MEM and160ml of 1M HEPES and bring the volume to 8.75 L using distilled water. Set the final PH to 7.4 and store it at 4°C. |
||||
References
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
- Morshead, C. M. Neural stem cells in the adult mammalian forebrain: a relatively quiescent subpopulation of subependymal cells. Neuron. 13, 1071-1082 (1994).
- Craig, C. G. In vivo growth factor expansion of endogenous subependymal neural precursor cell populations in the adult mouse brain. J Neurosci. 16, 2649-2658 (1996).
- Golmohammadi, M. G. Comparative analysis of the frequency and distribution of stem and progenitor cells in the adult mouse brain. Stem Cells. 26, 979-987 (2008).
- Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., BA, R. eynolds Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay. J Vis Exp. , (2010).
- Reynolds, B. A., Rietze, R. L. Neural stem cells and neurospheres--re-evaluating the relationship. Nat Methods. 2, 333-336 (2005).
- Louis, S. A. Enumeration of neural stem and progenitor cells in the neural colony-forming cell assay. Stem Cells. 26, 988-996 (2008).
