Summary
このビデオプロトコルは、胚14日目マウスの脳の神経節隆起から神経幹細胞の単離と拡大のためのニューロスアッセイのアプリケーションを示しています。
Abstract
哺乳類では、幹細胞は、動物の寿命の間にさまざまな組織や器官の細胞の起源と更新を維持するために未分化細胞のソースとして機能します。彼らは潜在的に老化の過程で、または負傷し、疾病の過程で失われた細胞を置き換えることができます。神経幹細胞（NSC）の存在が最初の小説、無血清培養系を用いて成体哺乳類の中枢神経系（CNS）、ニューロスフェアアッセイ（NSA）にレイノルズとWeiss（1992）によって記述されていた。このアッセイを使用して、それは胚の中枢神経系のさまざまな地域からのNSCを分離し、拡大することも可能です。 in vitroでの拡張のNSC でこれらは多能性であり、中枢神経系の三大細胞型を生じさせることができる。 NSAが実行するのが比較的簡単に思えますが、信頼性と一貫性のある結果を達成するために必要とされるここで示す手順に注意が必要です。このビデオでは、実質的にNSAは、胚性14日目マウスの脳組織からのNSCを生成し、拡大を示し、1つが再現可能なニューロスフェア培養を達成できるように技術的な詳細を提供します。手順は、単一の細胞懸濁液を得るために神経節隆起、NSCの培地で収穫した組織の解離を収穫するために、脳の顕微解剖をE14マウス胚を収穫し、最終的にNSAの培養中の細胞をプレーティングが含まれます。文化の中で5〜7日後、得られた一次ニューロスフェアは、さらに将来の実験のためのNSCの数を拡大して継代されています。
Protocol
1。基本的には、解剖に進む前に設定します。
- 完全なNSC媒体の適切な量はそれぞれ、9:1の比率でNeuroCult NSC基礎培地とNeuroCult NSC増殖サプリメントを混合して調製される。
- 培地は37℃の水浴で暖めています。
- 抗生物質の高濃度（10％）とコールドHEPES緩衝最小必須培地（HEM）は、解剖や洗浄を目的として作成されています。また、抗生物質の補充とNSC基礎培地はまた、この目的のために使用されることがあります。
- 抗生物質を含む冷HEMの25〜30 mLを胚の収集のための滅菌50mLのチューブに分注しています。
- いくつかの10cmのプラスチック製のペトリ皿を解剖中の胚や脳を保持するため、また、解剖組織を保持するために必要とされる。
- 胚（大はさみ、小さな尖ったハサミ、大型ピンセット、小さな湾曲鉗子）または胚の脳の解剖のための（小さな鉗子、湾曲した微細な鉗子、45 °傾斜細かい鉗子、そして小さなはさみ）を削除するために必要な手術器具は、使用して滅菌されています250ガラス玉滅菌器° Cまたは他の利用可能なオートクレーブ方法。
- 解剖顕微鏡は、70％アルコールで拭き取ると層流またはPC2のフード内に設定されています。
2。 E14マウス脳およびマイクロダイセクションを収穫。
- 妊娠中のマウスを交配時間は一日に自分の機関の承認された動物のプロトコルに従って、妊娠第 14 回麻酔です。
- 頸椎脱臼は、動物が苦痛を被ることはないか確認されます。
- 麻酔マウスは、吸収性ティッシュペーパーで、その後ろにレイアウトされ、そして腹部はエリアを殺菌するために70％エタノールでリンスする。
- 腹部の皮膚は、大規模な鉗子を用いて把握しているし、皮膚および基礎となる筋膜は、腹腔内および子宮角を公開する大型ハサミで切断されています。
- 子宮は小さな鉗子とはさみで除去し、50 mlコニカルチューブを含有する冷HEMをに転送されます。
- 子宮組織は、フードに転送され、血液や髪の毛のような可能性汚染物質を除去するために、新鮮な無菌冷たいHEMの十分な量で一度か二度洗浄する。
- 子宮組織は、その後コールドHEMを含む10センチメートルペトリ皿に移しています。
- 子宮角を小さく湾曲鉗子や鋏を使用して開かれ、胚は冷たいHEMを含む新しい10cmの皿に転送されます。
- 胚の頭部は、頚髄レベルで分離し、冷HEMを含む別のペトリ皿に移しています。
- ペトリ皿は、頭蓋骨から脳を削除するには解剖顕微鏡下で転送されます。
- ヘッドは、ヘッドの背側が上向きに直面しているように尾側から細かい曲がったピンセットで保持されます。マイクロはさみを使用して、最初の水平カットは目の上に作られ、次に頭の後ろに向かって額から正中線に続いた。皮膚や頭蓋骨を介してカットすると、基礎となる脳を損傷しないようにしてください。
- 脳は、湾曲鉗子を使用して後方にモーションで切断面の端を押して、頭蓋骨から削除されます。すべて脳が頭蓋骨から削除されるまでこの手順が続行されます。
- 脳は、背側が上向きに直面してmicroscissorsカットが神経節隆起を公開するために、嗅球から半球の後ろに伸びる各半球の皮質を介して実行されるを使用しているように湾曲した鉗子を使用して着実に開催されます。
- 片手で湾曲鉗子やその他の45 °傾斜鉗子を用いて、皮質のカットフラップが広がっていると神経節隆起が出解剖されています。
- 解剖組織を無菌10センチメートルペトリ皿に配置され、すべて脳がマイクロ解剖されるまで、この手順が繰り返される。
- 組織片は、1 mLのピペットチップでNSCの培地1mLを用いて採取し、15 mLの遠心管に移しています。
- 組織はその後、徹底的に、かつ慎重にチューブの底にピペットチップを押すと上下サスペンションをピペッティングにより解離している。この方法では、凝集塊は、単一の細胞に分割されています。ピペッティングは乳白色のような懸濁液が得られるように3-4回行われます。その後、懸濁液を非解離塊が沈殿するように1〜2分間静置しています。
- ほぼ全体の細胞懸濁液は、他のチューブに転送され、その後NSC媒体の別の1 mLを説明されているように、残りの塊と単一細胞に解離するために追加されます。
- チューブの含有量は、700rpm（110グラム）で、室温で5分のためにプールし、遠心分離されています。
- 上清は、実際のペレットにダウンオフ真空引きされ、細胞は完全なNSCの培地1mLに再懸濁する。
- 培地を穏やかに上下にピペッティングしています均質な単一の細胞懸濁液を持っている。
- 細胞懸濁液の10μLを、細胞数を数えるために、トリパンブルーの90μLと混合される。
- 最後に、細胞は、20ng / mLの上皮成長因子（EGF）を添加した完全なNSCの培地で2 × 10 5細胞/ mLの密度でプレーティングされています。 5 mLの培地は、T175フラスコ用T75および40mLのためのT25、20 mLのために使用されます。
- 37℃加湿インキュベーター中、5％のCO 2でインキュベートしたときにニューロスフェアは、5〜7日間に形成されています。 6-7日に、球は150から200ミクロンの間で測定する必要がありますし、サブカルチャー（通路）への準備が整います。
3。継代と胚NSCの拡張：
- ニューロスフェアは、サブカルチャー（直径150から200ミクロン）のための準備ができたら、一時停止球と培地は、フラスコから除去し、適切なサイズの滅菌組織培養チューブに入れ、そしてで5分間、700rpmで（110 g）で遠心分離され室温。
- 上清を捨て、球は％0.05トリプシン- EDTAを1 mLに再懸濁する。
- 細胞懸濁液を2〜3分間37℃の水浴中でインキュベートされている場合、大豆トリプシンインヒビターの等量のトリプシン活性を停止するために使用されます。
- 細胞懸濁液を穏やかにトリプシンが完全に不活化されていることを保証するために上下にピペッティングしています。
- 細胞懸濁液を5分間700rpmで（110グラム）で遠心分離する。その後、上清を除去し、細胞は完全なNSCの培地1mLに再懸濁する。
- 細胞懸濁液の10μLを、細胞数を数えるために、トリパンブルーの90μLと混合される。
- 細胞は、適切なサイズの組織培養フラスコで20ng / mLのEGFを補充した完全なNSCの培地で5 × 10 4細胞/ mLの濃度で播種されています。 5 mLの培地は、T175フラスコ用T75および40mLのためのT25、20 mLのために使用されます。
- 37℃加湿インキュベーター中、5％のCO 2でインキュベートしたときの二次ニューロスフェアは、5〜7日間に形成されています。
4。代表的な結果：
一次胚NSCの文化では、細胞の大部分は肥大になり、メッキ時に組織培養皿に付着する。細胞の大多数はどちらか死ぬかを区別しますが、2〜3日後、増殖細胞は、基板（図1）から切り離されて、細胞の小さなクラスターを作る。文化の最初の48時間の大球状凝集体の形成は、主球と誤解されるべきではない。凝集体形成は、主に破片や文化における非解離組織の塊の量に依存します。真のニューロスフェアは、位相明るく、サイズが大きくなる（図2）として、より球形になる。小さなmicrospikesは生存と健康な球体の外面（図3）に表示されます。 5〜7日後、球は丸いですが圧縮してはいけません、そして、直径150〜200μmを測定する必要があります。ニューロスフェアは、（文化9〜10日後）が大きすぎるを成長させるために許可されている場合、それらは、凝集体を形成するか（ビデオを参照）球の中心にいるため細胞死の色で暗くなることがあります。大規模なニューロスフェアは、最終的に（基板に装着し、周辺に向かって移行する） その場で差別化を開始することがあります。また、大規模なニューロスフェアを解離することは困難であり、それらをサブカルチャー。
図1。プライマリE14 NSCの文化は、めっき後の3日間。矢印は、NSCの増殖クラスタを示しています。オリジナルの倍率、20倍
図2。プライマリE14 NSCの文化めっき後の7日間。オリジナルの倍率、10倍
図3。めっき後のパッセージone E14ニューロスフェアを5日間を。球の周囲にマイクロスパイクを（矢印）に注意してください。オリジナルの倍率、20倍
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Discussion
ニューロスフェアのアッセイは、そのシンプルさと再現性の神経幹細胞1-5の分離と拡大のための選択の方法です。このアッセイは、in vitroおよびin vivo試験の両方に使用できる未分化のCNS 前駆細胞、の大規模な世代のための貴重なツールです。それは、ニューロスフェアは、善意の神経幹細胞とより限定された前駆細胞の両方から生成することができることが強調されるべきである。したがって、ニューロスフェア形成頻度を計算すると、単に任意の神経細胞集団6の善意のNSCの数を過大評価する。善意のNSCの頻度を推定するために、それは強く、この目的の7で開発された細胞アッセイを形成ニューラルコロニー（N -シミュレーションプロジェクト）を、使用することをお勧めします。
E14 NSCの一貫した高品質のニューロスフェアの文化を持っているために、お勧め：
- 胚を収穫を開始する前に必要な項目を準備する。
- 解剖を通して冷たいHEMまたは基礎NSC培地に胚を保つために。
- （1時間以内）可能な限り迅速に解剖を実行するには、組織が柔らかく、時間をかけて粘着性になり、解剖することは困難である可能性がある。
- 球があまり成長させないよう。通常、彼らは球の大きさに応じて継代培養ごとに5〜7日間でなければなりません。
- 2〜3分のための150から200ミクロンの大きさで球をトリプシンに。以上の3分間トリプシンのままにしておくと、細胞の損傷を引き起こし、球形成効率が低下すると細胞は培養皿を添付して差別化する傾向がある。
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Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Acknowledgments
この作品は、オーバストリート財団からの資金によってサポートされていました。
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| NeuroCult NSC Basal Medium | Medium | Stem Cell Technologies | 05700 | |
| NeuroCult NSC Proliferation Supplements | Medium supplement | Stem Cell Technologies | 05701 | |
| %0.05 trypsin-EDTA | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 25300-062 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Reagent | Sigma-Aldrich | T6522 | |
| Pen/Strep | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| *MEM | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 41500-018 | HEM component |
| *HEPES | Reagent | Sigma-Aldrich | H4034 | HEM component |
| *Distilled water | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15230-147 | |
| Cell strainer | Sieve | BD Biosciences | 352340 | |
| T25 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 136196 | |
| T80 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 178905 | |
| 15 ml tubes | Culture ware | BD Biosciences | 352096 | |
| 50 ml tubes | Culture ware | BD Biosciences | 352070 | |
| Fine curved forceps | Surgical tools | Fine Science Tools | 11251‐35 | |
| Small fine forceps | Surgical tools | Fine Science Tools | 11272‐30 | |
| Small forceps | Surgical tools | Fine Science Tools | 11050‐10 | |
| Fine scissors | Surgical tools | World Precision Instruments, Inc. | 500216 | |
| EGF | Growth factor | R&D Systems | 2028-EG | |
| b-FGF | Growth factor | R&D Systems | 3139-FB | |
| Heparin | Growth factor | Sigma-Aldrich | H4784 | Reconstituted in PBS |
*To make HEM, mix 1×10L packet of MEM and160ml of 1M HEPES and bring the volume to 8.75 L using distilled water. Set the final PH to 7.4 and store it at 4°C. |
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References
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
- Morshead, C. M. Neural stem cells in the adult mammalian forebrain: a relatively quiescent subpopulation of subependymal cells. Neuron. 13, 1071-1082 (1994).
- Craig, C. G. In vivo growth factor expansion of endogenous subependymal neural precursor cell populations in the adult mouse brain. J Neurosci. 16, 2649-2658 (1996).
- Golmohammadi, M. G. Comparative analysis of the frequency and distribution of stem and progenitor cells in the adult mouse brain. Stem Cells. 26, 979-987 (2008).
- Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., BA, R. eynolds Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay. J Vis Exp. , (2010).
- Reynolds, B. A., Rietze, R. L. Neural stem cells and neurospheres--re-evaluating the relationship. Nat Methods. 2, 333-336 (2005).
- Louis, S. A. Enumeration of neural stem and progenitor cells in the neural colony-forming cell assay. Stem Cells. 26, 988-996 (2008).
