Summary
이 비디오 프로토콜은 배아 일 14 마우스 뇌의 ganglionic eminences에서 신경 줄기 세포의 분리 및 확장에 대한 neurosphere 분석의 응용 프로그램을 보여줍니다.
Abstract
mammalians에서 줄기 세포는 동물의 수명 동안 여러 조직과 장기의 세포 창 및 갱신을 유지하기 위해 undifferentiated 세포의 소스 역할을합니다. 그들은 잠재적인 노화 과정에서 부상과 질병의 과정에서 길을 잃었 세포를 바꿀 수 있습니다. 신경 줄기 세포 (NSCs)의 존재가 처음 소설 혈청 무료 문화 시스템, neurosphere 분석 (NSA)를 사용하여 성인 포유류의 중추 신경계 (CNS)에 레이놀즈와 바이스 (1992)에 의해 설명되었다. 이 분석을 사용하여, 그것은 또한 배아 CNS의 다른 지역에서 NSCs을 분리하고 확장 가능합니다. 체외 확장의 NSCs에서 이들은 multipotent 있으며 CNS의 세 가지 주요 세포 유형 상승을 줄 수 있습니다. NSA가 수행하는 비교적 간단한데 동안 안정적이고 일관된 결과를 달성하기 위해 필요합니다 여기 증명 절차에주의. 이 비디오는 사실상 NSA가 14 마우스 뇌 조직을 생성하고 배아 날로부터 NSCs을 확장하는 방법을 보여줍니다 하나는 재현성 neurosphere 문화를 달성할 수 있도록 기술적인 세부 사항을 제공합니다. 프로 시저는 단일 세포 현탁액을 얻기 위해 NSC 매체에서 수확한 조직의 ganglionic eminences, 분리를 수확, 뇌 microdissection을 E14 마우스 배아를 수확하고, 마지막으로 NSA의 문화에 세포를 도금이 포함되어 있습니다. 문화 5-7일 후 결과 기본 neurospheres은 더 이후의 실험에 대한 NSCs의 수를 확장 passaged 있습니다.
Protocol
1. 기본은 절개로 진행하기 전에 설정 :
- 전체 NSC 매체의 적절한 볼륨이 각각 9시 1분 비율 NeuroCult NSC 기초 중간 및 NeuroCult NSC 확산 보조 식품을 혼합하여 준비가되어 있습니다.
- 매체는 37 ° C의 물을 욕조에 워밍업이다.
- 항생제의 높은 농도 (10 %)와 추위 HEPES 버퍼 최소 필수 매체 (앙)은 절개와 세탁 목적을 위해 준비가되어 있습니다. 또한, 항생제의 보완과 함께 NSC 기초 매체는 또한 이러한 목적으로 사용할 수 있습니다.
- 항생제를 포함하는 감기 앙의 25-30 ML은 배아를 수집 무균 50 ML 튜브에 적절합니다.
- 여러 10cm 플라스틱 배양 접시는 절개시 태아와 두뇌를 개최하는 데 필요한 또한 해부 조직을 개최합니다.
- 배아 (대형 가위, 작은 지적 가위, 큰 집게, 작은 곡선 포셉) 또는 배아 뇌 해부를위한 것이 (작은 포셉, 곡선 좋은 포셉, 45 ° 직각 좋은 포셉, 작은 가위)를 제거하기 위해 필요한 수술 도구는 사용 소독 아르 250 유리 구슬 살균기 ° C 또는 기타 가능한 압력솥 방법.
- 해부 현미경은 70 % 알코올로 닦아 및 층류 또는 PC2 후드 내부에 설정됩니다.
2. E14 마우스 두뇌와 마이크로 절개를 수확 :
- 임신 마우스를 성관계 시간이 하루에 하나의 기관 승인 동물 프로토콜에 따라 태동 14 일 anesthetized입니다.
- 자궁 경부 전위는 동물이 고통과 고통을 경험하게하지 않도록하기 위해 수행됩니다.
- anesthetized 마우스는 흡수성 티슈에 미치는 뒷면에 마련이고, 복부는 지역을 소독하기 위해 70 %의 에탄올로 씻어서 있습니다.
- 복부 이상의 피부는 큰 집게를 사용하여 파악하고, 다음 피부와 기본 근막은 복강과 자궁 뿔을 폭로 큰 가위로 절단됩니다.
- uteri 작은 집게와 가위로 제거되고 50 ML 원뿔 튜브 함유 추위 앙을로 전송됩니다.
- 자궁 조직이 후드로 전송 후 혈액과 머리카락과 같은 가능한 오염 물질을 제거하는 신선한 무균 추위 앙의 충분한 볼륨 한두 번 씻어서 있습니다.
- 자궁 조직은 다음 차가운 앙을 포함 10cm 페트리 접시로 전송됩니다.
- 자궁 뿔은 작은 곡선 집게와 가위를 사용하여 개설하고 배아는 추위 앙을 포함하는 새로운 10cm 요리로 전송됩니다.
- 태아의 머리가 자궁 경부 척수 수준에서 분리되어 추위 앙을 포함하는 다른 페트리 접시로 전송됩니다.
- 페트리 접시는 두개골에서 뇌를 제거하는 해부 현미경으로 전송됩니다.
- 머리는 머리의 등 부분의 면이 위쪽 직면만큼 꼬리 측면에서 멋진 곡선 포셉 개최하고 있습니다. 를 사용하여 마이크로 가위, 먼저 수평 상처가 눈 위에서 만든 다음 머리 뒤쪽으로 이마의 정중선에서 계속됩니다. 피부와 두개골을 통해 절감과 기본 뇌 손상하지 않도록하십시오.
- 두뇌는 곡선 집게를 사용하여 역방향 움직임에 절단 부분의 가장자리를 추진하여 두개골에서 제거됩니다. 모든 두뇌는 두개골에서 제거되기 전까지는이 절차는 계속됩니다.
- 두뇌는 지속 등의 측면이 상처가 후각 구근에서 ganglionic eminences을 폭로하는 북반구의 뒷면에 걸친 각 반구의 피질을 통해 수행되는 microscissors를 사용하는 이상하고 직면되도록 곡선 집게를 사용하여 개최됩니다.
- 한손에 곡선 포셉와 다른 45 ° 직각 집게를 사용하여 cortices의 컷 펄럭이 확산되고 ganglionic eminences 밖을 해부하고 있습니다.
- 해부 조직은 멸균 10cm 페트리 접시에 배치되며, 모든 머리가 마이크로 해부 때까지이 절차가 반복됩니다.
- 조직 조각은 1 ML 피펫 팁의 NSC 매체 1 ML을 사용하여 수집하고 15 ML의 원심 관으로 전송됩니다.
- 조직은 철저히 다음 dissociated이지만, 부드럽게 튜브의 바닥에 피펫 팁을 누르고 정지를 pipetting 아래로. 이 방법은 대단히 짧은 시간은 단일 세포로 헤어 졌 수 있습니다. Pipetting는 우유 같은 현탁액이 달성되도록 3-4 회를 실시합니다. 그런 다음, 정지가 아닌 dissociated 대단히 짧은 시간이 precipitates만큼 1~2분을 받아들여야 허용됩니다.
- 거의 모든 세포 현탁액은 다른 튜브로 전송됩니다 그리고 NSC 매체의 또 다른 한 ML은 설명된대로 남아있는 대단히 짧은 시간 및 단일 세포에 dissociated에 추가됩니다.
- 튜브의 내용은 700rpm (110g)에서, 실온에서 5 분 풀링 및 centrifuged 있습니다.
- 뜨는은 실제 펠렛 아래로 떨어져 진공 청소기로 청소를하고, 세포가 완전한 NSC 매체 1 ML에 resuspended 있습니다.
- 매체는 부드럽게하기 위해 아래 pipetted 있으며단일 단일 세포 현탁액 있습니다.
- 세포 현탁액의 10 μL는 셀 카운트를 수행하는 trypan 파랑 90 μL와 혼합됩니다.
- 마지막으로, 세포가 20ng / ML 표피 성장 인자 (EGF)와 보충 전체 NSC 매체에 2x10 5 셀 / ML의 밀도에 도금입니다. 5 ML 매체는 T175 flasks에 대한 T75 40 ML에 대한 T25, 20 ML에 사용됩니다.
- 37 ° humidified 인큐베이터에서 C 5 % CO 2에서 incubated 때 Neurospheres는 5~7일를 형성하고 있습니다. 6-7일에서 분야는 150-200 미크론 사이에 측정해야하며 subculture (통로)을 준비합니다.
3. Passaging 및 배아 NSCs의 확장 :
- neurospheres가 subculture (직경 150-200 μm의)에 대한 준비가되면, 중지 분야와 매체는 flasks에서 삭제 적절한 크기 무균 조직 배양 튜브에 배치하고,시 5 분 700 RPM (110g)에 centrifuged입니다 상온.
- 뜨는은 삭제되고 분야는 0.05 % 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 1 ML에 resuspended 있습니다.
- 세포 현탁액은 다음 2-3 분 37 ° C의 물을 욕조에 incubated이며, 다음 대두 트립신 억제제의 동등한 볼륨 트립신의 활동을 중지하는 데 사용됩니다.
- 세포 현탁액은 부드럽게 트립신가 완전히 inactivated되었는지 확인하기 위해 아래 pipetted하고 있습니다.
- 세포 현탁액은 5 분 700 RPM (110g)에 centrifuged입니다. 그런 다음, 표면에 뜨는이 제거되고 세포 전체 NSC 매체 1 ML에 resuspended 있습니다.
- 세포 현탁액의 10 μL는 셀 카운트를 수행하는 trypan 파랑 90 μL와 혼합됩니다.
- 세포는 적절한 크기의 조직 문화 플라스크에 20ng / ML EGF와 보충 전체 NSC 매체에 5x10 4 셀 / ML의 농도에 도금입니다. 5 ML 매체는 T175 flasks에 대한 T75 40 ML에 대한 T25, 20 ML에 사용됩니다.
- 37 ° humidified 인큐베이터에서 C 5 % CO 2에서 incubated 때 보조 neurospheres는 5~7일를 형성하고 있습니다.
4. 대표 결과 :
기본 배아 NSC 문화에서, 세포의 대부분은 비대가 될 것이며, 도금시 조직 문화 요리에 첨부합니다. 세포의 대부분이 중 죽게하거나 2-3일 후 차별화되지만, proliferative 전지는 기판 (그림 1)에서 분리됩니다 세포의 작은 클러스터를합니다. 문화의 첫 48 시간에 큰 회전 타원체의 집계의 형성은 주요 분야에 대한 착각해서는 안됩니다. 집계 형성은 주로 파편과 문화의 비 dissociated 조직 대단히 짧은 시간의 양을에 따라 달라집니다. 진정한 neurospheres이 단계 밝고하고 크기 증가 (그림 2)와 같은 더 구형이된다. 작은 microspikes이 가능한 건강 분야 (그림 3)의 바깥쪽 표면에 나타납니다. 5~7일 후, 분야는 둥근 수 있지만 압축 안된다, 그리고 직경 150 사이 200 μm의 측정해야합니다. neurospheres가 (문화 9~10일 이후) 너무 커질 수있다면, 그들은 집계를 형성하거나 (비디오 참조) 분야의 중심에 있기 때문에 세포 죽음의 어두운 색상이 될 수도 있습니다. 대형 neurospheres 결국 (기판에 연결하여 주변위한 마이 그 레이션) 현장에서 차별 시작 있습니다. 그것은 또한 큰 neurospheres을 떼어 놓다하기 어려운 그들을 subculture.
그림 1. 삼일 도금 후 기본 E14 NSC 문화. 화살표 NSCs의 proliferating 클러스터를 보여줍니다. 원본 확대, 20x
그림 2. 칠일 도금 후 기본 E14 NSC 문화. 원본 확대, 10X
그림 3. 도금 후 패시지 한 E14 neurospheres 오일합니다. 분야의 주변에있는 마이크로 스파이크를 (화살표) 참고. 원본 확대, 20x
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Discussion
neurosphere 분석 때문에 간단하고 재현성의 신경 줄기 세포 1-5의 격리 및 확장을 위해 선택의 방법입니다. 이 분석은 체외에서 생체내 연구에서 모두 사용할 수 undifferentiated CNS 전구체 세포의 대규모 발전을위한 소중한 도구입니다. 그것은 neurospheres는 타고난 신경 줄기 세포 및 기타 제한된 progenitors 모두에서 발생 될 수 있다고 강조해야합니다. 따라서 neurosphere 성형 주파수를 계산하는 것은 단순히 특정 신경 세포 인구 6 타고난 NSCs의 개수를 과대 평가. 타고난 NSCs의 빈도를 추정하기 위해, 그것은 강력하게이 목적 7에 대한 개발되었습니다 세포 분석을 형성 신경 콜로니 (N - CFCA)를 사용하는 것이 좋습니다.
E14 NSCs의 일관된 고품질 neurosphere 문화를 위해, 우리는 좋습니다
- 배아를 수확하기 시작하기 전에 필요한 항목을 준비합니다.
- 해부 내내 감기 앙 또는 기초 NSC 매체에서 배아를 유지합니다.
- (1 H 이내) 가능한 한 빨리 절개를 수행하려면, 조직이 부드럽고 시간이 지남에 끈적끈적한되고 해부하다하기 어려울 수 있으므로.
- 영역이 너무 많이 성장하도록하지 않습니다. 보통 그들은 분야의 크기에 따라 하위 교양 모든 5~7일해야합니다.
- 2~3분에 대한 150-200 μm의 크기에서 분야를 trypsinize합니다. 이상 3 분 트립신을 떠나하면 세포에 손상을 원인과 구체 형성 효율이 저하되고 세포가 문화 요리를 첨부하고 차별하는 경향이 있습니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 작품은 오버 재단 기금에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| NeuroCult NSC Basal Medium | Medium | Stem Cell Technologies | 05700 | |
| NeuroCult NSC Proliferation Supplements | Medium supplement | Stem Cell Technologies | 05701 | |
| %0.05 trypsin-EDTA | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 25300-062 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Reagent | Sigma-Aldrich | T6522 | |
| Pen/Strep | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| *MEM | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 41500-018 | HEM component |
| *HEPES | Reagent | Sigma-Aldrich | H4034 | HEM component |
| *Distilled water | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15230-147 | |
| Cell strainer | Sieve | BD Biosciences | 352340 | |
| T25 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 136196 | |
| T80 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 178905 | |
| 15 ml tubes | Culture ware | BD Biosciences | 352096 | |
| 50 ml tubes | Culture ware | BD Biosciences | 352070 | |
| Fine curved forceps | Surgical tools | Fine Science Tools | 11251‐35 | |
| Small fine forceps | Surgical tools | Fine Science Tools | 11272‐30 | |
| Small forceps | Surgical tools | Fine Science Tools | 11050‐10 | |
| Fine scissors | Surgical tools | World Precision Instruments, Inc. | 500216 | |
| EGF | Growth factor | R&D Systems | 2028-EG | |
| b-FGF | Growth factor | R&D Systems | 3139-FB | |
| Heparin | Growth factor | Sigma-Aldrich | H4784 | Reconstituted in PBS |
*To make HEM, mix 1×10L packet of MEM and160ml of 1M HEPES and bring the volume to 8.75 L using distilled water. Set the final PH to 7.4 and store it at 4°C. |
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References
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
- Morshead, C. M. Neural stem cells in the adult mammalian forebrain: a relatively quiescent subpopulation of subependymal cells. Neuron. 13, 1071-1082 (1994).
- Craig, C. G. In vivo growth factor expansion of endogenous subependymal neural precursor cell populations in the adult mouse brain. J Neurosci. 16, 2649-2658 (1996).
- Golmohammadi, M. G. Comparative analysis of the frequency and distribution of stem and progenitor cells in the adult mouse brain. Stem Cells. 26, 979-987 (2008).
- Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., BA, R. eynolds Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay. J Vis Exp. , (2010).
- Reynolds, B. A., Rietze, R. L. Neural stem cells and neurospheres--re-evaluating the relationship. Nat Methods. 2, 333-336 (2005).
- Louis, S. A. Enumeration of neural stem and progenitor cells in the neural colony-forming cell assay. Stem Cells. 26, 988-996 (2008).
