Summary
Bu video protokolü, embriyonik gün 14-fare beyninde ganglion eminences nöral kök hücrelerin izolasyonu ve genişleme için neurosphere testinin uygulama göstermektedir.
Abstract
Memelilerde, kök hücreleri farklılaşmamış hücreler, hayvanın ömrü boyunca, farklı doku ve organlarda hücre doğuşu ve yenileme korumak için bir kaynak olarak görür. Bu potansiyel yaşlanma sürecini veya yaralanma ve hastalık sürecinde kaybolur hücreleri değiştirebilirsiniz. Nöral kök hücrelerin varlığı (NSC'lerde) ilk roman serum serbest bir kültür sistemi, neurosphere assay (NSA) ile yetişkin memelilerin merkezi sinir sistemi (MSS) Reynolds ve Weiss (1992) tarafından tarif edilmiştir. Bu testte, aynı zamanda, farklı bölgelerinden embriyonik MSS NSC'lerde izole etmek ve genişletmek için uygulanabilir. Bu in vitro genişletilmiş NSC'lerde multipotent ve MSS üç önemli hücre tiplerinin ortaya çıkmasına neden olabilir. NSA gerçekleştirmek için nispeten basit olmakla birlikte, güvenilir ve tutarlı sonuçlar elde etmek için gerekli Burada gösterilen usul dikkat. Bu video pratik NSA 14-fare beyin dokusu oluşturmak ve embriyonik günden itibaren NSC'lerde genişletmek gösterir ve teknik detaylar bir tekrarlanabilir neurosphere kültürleri elde edebilirsiniz sağlar. Bu prosedür, tek bir hücre süspansiyonu elde etmek için MGK orta hasat doku ganglion eminences, disosiyasyon hasat, beyin mikrodiseksiyon E14 fare embriyoları, hasat ve son olarak NSA kültür hücreleri kaplama içerir. Kültür 5-7 gün sonra, ortaya çıkan birincil neurospheres daha sonraki deneyler için NSC'lerde sayısını artırmak için geçişli.
Protocol
1. Diseksiyon için Başlamadan Önce Temel Set Up:
- Tam MGK orta Uygun hacmi, 09:01 oranında NeuroCult MGK Bazal Orta ve NeuroCult MGK Silahların Yayılmasını Önleme Takviyeler sırasıyla karıştırılarak hazırlanır.
- Orta, 37 ° C su banyosunda ısıtılır.
- Antibiyotik yüksek konsantrasyonda (% 10) Soğuk Hepes-tamponlu asgari temel orta (HEM), diseksiyon ve yıkama amacı için hazırlanmıştır. Alternatif olarak, antibiyotik takviyesi ile MGK bazal orta de bu amaç için kullanılan olabilir.
- 25-30 ml antibiyotik içeren soğuk HEM embriyoların toplanması için 50 mL steril tüpler içine sürülür.
- Birkaç 10cm plastik Petri kutularına Diseksiyon sırasında embriyoların ve beyinleri tutmak için gerekli olan ve aynı zamanda doku disseke tutun.
- Embriyolar (büyük makas, küçük sivri makas, büyük forseps, küçük kavisli bir forseps) veya embriyonik beyin diseksiyon (küçük forseps, kıvrımlı ince forseps, 45 ° açılı ince forseps, küçük makas) kaldırmak için gerekli cerrahi aletler kullanılarak sterilize edilir cam boncuk sterilizatör 250 ° C veya diğer mevcut otoklav yöntemleri.
- Diseksiyon mikroskobu,% 70 alkol ile sildi ve laminer akış veya PC2 kaput içinde kurulur.
2. E14 Fare Beyin ve Mikro-disseksiyon Hasat:
- Hamile fare evlendirilen bir süre günde bir kurumsal onaylı hayvan protokolü göre 14. gebelik uyuşturulduktan.
- Servikal dislokasyon hayvanın acı ve sıkıntı zarar vermez emin olmak için yapılır.
- Anestezi fare, emici bir kağıt mendil sırtını üzerine koydu ve karın alan sterilize etmek için% 70 etanol ile yıkanır.
- Cilt karın üzerinde büyük bir forseps kullanarak kavradı ve sonra, cilt ve altta yatan fasya, karın boşluğu ve rahim boynuzları ortaya çıkarmak için büyük bir makas ile kesilir.
- Uteri küçük forseps ve makas ile kaldırılır ve 50 ml konik tüp içeren soğuk HEM aktarılır.
- Rahim dokuları Kaputun aktarılır ve daha sonra kan ve saç gibi olası kirleri çıkarmak için bir veya iki kez taze steril soğuk HEM yeterli hacmi ile durulanır.
- Rahim dokuları sonra 10cm Petri kabı soğuk HEM içeren bir transfer edilir.
- Uterus boynuzları küçük kavisli bir forseps ve makas kullanılarak açılır ve soğuk HEM içeren yeni bir 10cm çanak, embriyolar transfer edilir.
- Embriyoların başkanları servikal spinal kord düzeyinde ayrılmış ve başka bir Petri kabı soğuk HEM içeren transfer.
- Petri kabı kafatası beyin kaldırmak için diseksiyon mikroskop altında aktarılır.
- Kafaları başkanlarının dorsal tarafı yukarı bakacak şekilde kaudal tarafında ince kavisli bir forseps ile yapılmaktadır. Kullanarak mikro-makas, gözleri üzerinde ilk yatay bir kesim yapılmış ve daha sonra başın arkasına doğru alında orta hatta devam etti. Deri ve kafatası kesti ve altta yatan bir beyin hasarı değil emin olun.
- Beyin kafatası kesik bölümünün kenarları kavisli bir forseps kullanarak geriye doğru hareket basarak kaldırılır. Bu prosedür tüm beyinleri kafatası kaldırılıncaya kadar devam eder.
- Beyin dorsal tarafına bir kesim koku ampuller ganglion eminences maruz yarımkürenin arkasına uzanan her yarımkürenin korteks ile gerçekleştirilir microscissors kullanarak yukarı ve ardından bakacak şekilde kavisli bir forseps kullanarak sabit tutulur.
- Bir yandan kavisli bir forseps ve diğer 45 ° açılı forseps kullanarak, korteks kesme flep yayılmış ve ganglion eminences disseke vardır.
- Disseke doku steril bir 10cm Petri kabı yerleştirilir ve tüm beyinleri mikro-disseke kadar bu işlem tekrarlanır.
- Doku parçaları MGK orta 1 ml 1 ml pipet kullanılarak toplanan ve 15 ml santrifüj tüpüne aktarılır.
- Doku sonra iyice ayrışmış, ama nazikçe pipet tüpün dibine basarak ve süspansiyon yukarı ve aşağı pipetleme. Bu şekilde tek bir hücre içine yığınları kırık. Pipetleme sütlü gibi bir süspansiyon elde edilir, böylece 3-4 kez yapılır. Daha sonra, süspansiyon 1-2 dakika kadar ayrışmış olmayan kümeleri çökeltileri yerleşmek için izin verilir.
- Hemen hemen tüm hücre süspansiyonu diğer tüpe aktarılır ve daha sonra başka bir 1 ml MGK orta açıklandığı gibi kalan tek bir hücre kümeleri ve ayrışmış eklenir.
- Tüplerin içeriği 700Rpm (110g), oda sıcaklığında 5 dakika boyunca toplanmış ve santrifüj edilir.
- Süpernatant aşağı gerçek pelet kapalı vakumlu, ve hücrelerin tam MGK orta 1 mL yeniden süspanse.
- Orta hafifçe aşağı yukarı pipetlenir.homojen bir tek hücre süspansiyonu var.
- Hücre süspansiyonu 10 mcL bir hücre sayımı gerçekleştirmek için 90 tripan mavi mcL ile karıştırılır.
- Son olarak, hücreler 2x10 5 hücre / mL 20ng / ml epidermal büyüme faktörü (EGF) ile desteklenmiş tam MGK orta yoğunlukta kaplanmıştır. 5 ml orta, T25, T75 ve T175 şişeler için 40 ml 20 ml için kullanılır.
- 37 ° C,% 5 ile nemlendirilmiş bir inkübatör CO 2 inkübe Neurospheres 5-7 gün içinde oluşur . 6-7 gün içinde, küreler 150-200 mikron arasında ölçmelidir ve altkültürü (geçit) hazır olacaktır.
3. Embriyonik NSC'lerde Pasajlanması ve genişletilmesi:
- Neurospheres altkültürü (150-200 mikron çapında) için hazır olduğunuzda, orta askıya küreler, şişeler kaldırılır uygun bir boyut steril doku kültürü tüp yerleştirilir ve 700 rpm (110 g) 5 dakika santrifüj oda sıcaklığında bekletin.
- Süpernatant atılır ve küreler 1 mL% 0.05 tripsin-EDTA yeniden süspanse.
- Hücre süspansiyonu daha sonra 2-3 dakika süreyle 37 ° C su banyosunda inkübe edilir, sonra soya tripsin inhibitörü eşit miktarda tripsin faaliyeti durdurmak için kullanılır.
- Hücre süspansiyonu tripsin tamamen inaktive olduğundan emin olmak için hafifçe aşağı yukarı pipetlenir ve.
- Hücre süspansiyonu, 5 dakika süreyle 700 rpm (110g) santrifüj edilir. Sonra süpernatantı kaldırılır ve hücrelerin tam MGK orta 1 mL yeniden süspanse.
- Hücre süspansiyonu 10 mcL bir hücre sayımı gerçekleştirmek için 90 tripan mavi mcL ile karıştırılır.
- Hücreleri uygun bir boyut doku kültürü şişesi 20ng / ml EGF ile desteklenmiş tam MGK orta 5x10 4 hücre / mL konsantrasyonda kaplanmıştır. 5 ml orta, T25, T75 ve T175 şişeler için 40 ml 20 ml için kullanılır.
- 37 ° C,% 5 ile nemlendirilmiş bir inkübatör CO 2 inkübe İkincil neurospheres 5-7 gün içinde oluşur .
4. Temsilcisi Sonuçlar:
Birincil embriyonik MGK kültürü, hücrelerin çoğunluğunu hipertrofik olacak ve kaplama üzerine doku kültürü yemekleri ekleyin. Hücrelerin çoğunluğu ya ölür ya da 2-3 gün sonra, ayırt ederken, proliferatif hücreler substrat (Şekil 1) ayırmak hücrelerinin küçük kümeler olun. Kültürün ilk 48 saat içinde büyük sfero agrega oluşumu primer küreler için yanlış olmamalıdır. Agrega oluşumu ağırlıklı olarak enkaz ve kültürü olmayan ayrışmış doku kümeleri tutarlar bağlıdır. Gerçek neurospheres faz parlak ve boyutunu artırır (Şekil 2) gibi daha küresel hale. Küçük microspikes sağlıklı ve canlı küre (Şekil 3) dış yüzeyinde görünür. 5-7 gün sonra, küreler yuvarlak olabilir ama sıkıştırılmış değil; ve çapı 150 ila 200 mikron ölçmelidir. Neurospheres (9-10 gün sonra kültür) çok büyük büyümek için izin verilirse, onlar agrega form veya küre merkezinde (video) hücre ölümü nedeniyle koyu renkli olabilir. Büyük neurospheres sonunda in situ (substrat bağlama ve çevre doğru göç) ayırt etmek için başlayabilir. Aynı zamanda büyük neurospheres ayırmak zordur ve bunları altkültürü.
Şekil 1. İlköğretim E14 MGK kültür kaplama 3 gün sonra. Oklar NSC'lerde prolifere kümeleri göstermektedir. Orijinal büyütme; 20x
Şekil 2 İlköğretim E14 MGK kültür kaplama 7 gün sonra. Orijinal büyütme; 10x
Şekil 3 Passage bir E14 neurospheres 5 gün sonra kaplama. Küreler çevresindeki mikro-ani (oklar) dikkat edin. Orijinal Büyütme; 20x
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Neurosphere tahlil sadeliği ve tekrarlanabilirlik nedeniyle nöral kök hücreler 1-5 izolasyonu ve genişleme için tercih edilen bir yöntemdir. Bu testte hem de in vitro ve in vivo çalışmalar için kullanılan olabilir farklılaşmamış MSS öncü hücreler, büyük ölçekli üretimi için paha biçilmez bir araçtır. Neurospheres iyi niyetli nöral kök hücreler ve daha sınırlı atalarıdır hem olabileceği vurgulanmalıdır. Bu nedenle, neurosphere oluşturan frekans hesaplanırken, sadece iyi niyetli NSC'lerde herhangi bir sinir hücresinin nüfusu 6 olduğundan yük . Iyi niyetli NSC'lerde sıklığını tahmin etmek, bu amaçla 7 için geliştirilmiştir Hücre Testi Şekillendirme Sinir Colony (N-CFCA) kullanılması tavsiye edilir.
E14 NSC'lerde tutarlı bir yüksek kalite neurosphere kültüre sahip olması için, bizim önerimiz:
- Embriyolar hasat başlamadan önce gerekli öğeleri hazırlamak için.
- Diseksiyon boyunca soğuk HEM veya bazal MGK orta embriyolar tutmak için.
- 1 saat içinde mümkün olduğunca çabuk diseksiyon için, doku zamanla yumuşak ve yapışkan hale gelir ve incelemek için zor olabilir.
- Alanında çok fazla büyümesine izin vermemek. Genellikle küre büyüklüğüne bağlı olarak, alt-kültür her 5-7 gün olmalıdır.
- 2-3 dakika boyunca 150-200 mikron boyutunda küreler trypsinize. 3 dakikadan daha fazla tripsin bırakmak hücrelere zarar verir ve küre oluşturan etkinliği azalacak ve hücrelerin kültür kaplarına takın ve ayırt etmek eğiliminde olacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu çalışma Overstreet Vakfı parasal destek verdi.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| NeuroCult NSC Basal Medium | Medium | Stem Cell Technologies | 05700 | |
| NeuroCult NSC Proliferation Supplements | Medium supplement | Stem Cell Technologies | 05701 | |
| %0.05 trypsin-EDTA | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 25300-062 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Reagent | Sigma-Aldrich | T6522 | |
| Pen/Strep | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| *MEM | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 41500-018 | HEM component |
| *HEPES | Reagent | Sigma-Aldrich | H4034 | HEM component |
| *Distilled water | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15230-147 | |
| Cell strainer | Sieve | BD Biosciences | 352340 | |
| T25 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 136196 | |
| T80 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 178905 | |
| 15 ml tubes | Culture ware | BD Biosciences | 352096 | |
| 50 ml tubes | Culture ware | BD Biosciences | 352070 | |
| Fine curved forceps | Surgical tools | Fine Science Tools | 11251‐35 | |
| Small fine forceps | Surgical tools | Fine Science Tools | 11272‐30 | |
| Small forceps | Surgical tools | Fine Science Tools | 11050‐10 | |
| Fine scissors | Surgical tools | World Precision Instruments, Inc. | 500216 | |
| EGF | Growth factor | R&D Systems | 2028-EG | |
| b-FGF | Growth factor | R&D Systems | 3139-FB | |
| Heparin | Growth factor | Sigma-Aldrich | H4784 | Reconstituted in PBS |
*To make HEM, mix 1×10L packet of MEM and160ml of 1M HEPES and bring the volume to 8.75 L using distilled water. Set the final PH to 7.4 and store it at 4°C. |
||||
References
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
- Morshead, C. M. Neural stem cells in the adult mammalian forebrain: a relatively quiescent subpopulation of subependymal cells. Neuron. 13, 1071-1082 (1994).
- Craig, C. G. In vivo growth factor expansion of endogenous subependymal neural precursor cell populations in the adult mouse brain. J Neurosci. 16, 2649-2658 (1996).
- Golmohammadi, M. G. Comparative analysis of the frequency and distribution of stem and progenitor cells in the adult mouse brain. Stem Cells. 26, 979-987 (2008).
- Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., BA, R. eynolds Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay. J Vis Exp. , (2010).
- Reynolds, B. A., Rietze, R. L. Neural stem cells and neurospheres--re-evaluating the relationship. Nat Methods. 2, 333-336 (2005).
- Louis, S. A. Enumeration of neural stem and progenitor cells in the neural colony-forming cell assay. Stem Cells. 26, 988-996 (2008).
