Summary
يصف هذا البروتوكول شاشة إنتاجية عالية للنشاط cellulolytic من مكتبة metagenomic أعرب في القولونية. الشاشة هو حل قائم ومؤتمتة للغاية ، ويستخدم واحد في 384 وعاء الكيمياء microplates جيدا مع قراءات النهائي باعتبارها قياس الامتصاصية.
Abstract
السليلوز ، المصدر الأكثر وفرة من الكربون العضوي على كوكب الأرض ، واسعة النطاق التطبيقات الصناعية ، مع التركيز على زيادة إنتاج الوقود الحيوي 1. الطرق الكيميائية لتعديل أو تتحلل السليلوز تتطلب عادة الأحماض القوية ودرجات الحرارة المرتفعة. على هذا النحو ، أصبحت الطرق الأنزيمية بارز في عملية التحويل البيولوجي. في حين أن تحديد السليلوزات نشطة من العزلات البكتيرية والفطرية كانت فعالة الى حد ما ، فإن الغالبية العظمى من الميكروبات في الطبيعة مقاومة زراعة المختبر. الجينومية البيئية ، والمعروف أيضا باسم metagenomic النهج ، وفحص وعدا كبيرا في سد الفجوة زراعة في البحث عن الانزيمات التحويل البيولوجي الرواية. استعادت النهج بنجاح الفحص Metagenomic السليلوزات الرواية من بيئات متنوعة مثل التربة 2 ، 3 الجاموس الكرش والأمعاء النمل الأبيض الخلفيتين ، 4 باستخدام لوحات كربوكسي ميثيل سلولوز آغار (CMC) ملطخة صبغ أحمر الكونغو (على أساس أسلوب Teather والخشب 5). ومع ذلك ، يقتصر على الأسلوب CMC في الإنتاجية ، وليس الكمية ويظهر إشارة إلى انخفاض نسبة الضوضاء 6. وقد ذكرت وسائل أخرى 7،8 لكن كل استخدام لوحة أغار على أساس الفحص ، وهو غير مرغوب فيه لالفرز الفائق الإنتاجية الكبيرة المكتبات الجينومية إدراج هنا نقدم حلا يستند إلى الشاشة لنشاط سلولاز باستخدام نيتروفينول مولد اللون (DNP) - cellobioside الركيزة 9. تم استنساخ لدينا في المكتبة نسخة pCC1 fosmid السيطرة على زيادة حساسية الفحص من خلال تحريض عدد النسخ 10. ويستخدم أسلوب واحد في وعاء الكيمياء 384 جيدا microplates مع قراءات النهائية على النحو المنصوص عليه قياس الامتصاصية. هذه هي الكمية قراءات وحساسة والآلي مع سرعة تصل إلى 384 لوحات 100X جيدا يوميا باستخدام معالج السائل والقارئ لوحة المرفقة مع نظام التكديس.
Protocol
قبل البدء في هذا البروتوكول ، وسوف تحتاج مكتبتك metagenomic المخزنة في شكل 384 صفيحة جيدا. في دراستنا ، استخدمنا نسخة السيطرة pCC1 ناقلات fosmid في تركيبة مع TransforMax بالعاثية T1 المقاوم EPI300 R - T1 E. الخلايا القولونية كمضيف مكتبة ومخزن لوحات لدينا في 11 -80 درجة مئوية.
1. تكرار لوحات المكتبة Metagenomic
- تذويب لوحات تحتوي المكتبة على 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة تقريبا ، أو حتى يتم إذابة جميع الآبار.
- استخدام ميزة ضوء الأشعة فوق البنفسجية في تعقيم لتعقيم qPix2 الروبوت لمدة 15 دقيقة.
- تحضير مرق LB مع الكلورامفينيكول بتركيز نهائي 12.5ug/mL وأرابينوز في 100ug/mL في زجاجة الكاشف 500mL. وسوف تستخدم كل لوحة 20mL تقريبا ، بالإضافة إلى إجراء 50mL إضافية للسماح لحجم القتلى.
- إعداد qFill3 وتعليمات الشركة الصانعة في زجاجة مع وسائل الاعلام التابعة لمشعب عبر أنابيب معقمة. البرنامج الذي لكمية مناسبة من وسائل الإعلام ، وتعيين لملء حجم 45uL في كل بئر.
- تطهير الهواء من الأنابيب المتعددة وباستخدام ميزة تطهير الروبوت حتى وسائل الاعلام المرئية والقادمة من كل طرف من الجوانب.
- ملء العدد المرغوب فيه من لوحات مع وسائل الاعلام LB باستخدام qFill3. كل لوحة يستغرق نحو 20 ثانية لملء الفراغ.
- تحميل لوحات لوحات ومكتبة جديدة في المناطق المناسبة للروبوت qPix2. ملء حمامات التنظيف مع الكواشف المناسبة ؛ 2 ٪ Micro90 في الحمام الخلفي ، وتعقيمها الماء المقطر في الحمام المتوسطة ، و 80 ٪ من الإيثانول في الحمام الجبهة.
- استخدام "تكرار" برنامج qPix2. في البرنامج ، حدد المناسبة الرأس ، وعدد وأنواع لوحات لوحات المصدر والوجهة. كذلك وضعت على رأس لتنظيف بين replications ، وعادة 6 دورات في كل الحمام بما فيه الكفاية. قدرة الجهاز هو 10 لوحات في كل مرة ، ويستغرق حوالي 15 دقيقة لتكرار كل منهم برأس دبوس 384 (أو ما يقرب من 50 دقيقة مع رئيس دبوس 96).
ملاحظة : لا يوجد خيار "تحريك المصدر" أو "تحريك الوجهة". فمن المستحسن عدم استخدام هذه الخيارات والمشاكل التي حدثت في السابق مع الروبوت لدينا استخدامها. - مرة واحدة يتم نسخ لوحات ، وتنمو على لوحات في 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة في مربع الرطوبة. لأننا الأمر الذي أدى إلى ارتفاع في عدد النسخ fosmid مع اضافة أرابينوز ، واستنساخ تميل إلى النمو أبطأ من التي يسببها عدم استنساخ. عودة لوحات المكتبة ل-80 درجة مئوية.
ملاحظة : الحضانة في مربع يضمن تبخر الرطوبة وسائل الاعلام لا تحدث في الآبار على حافة الصفائح ، والحفاظ على بيئة موحدة لجميع الآبار. - تنظيف qFill3 الروبوت من خلال تطهير المياه لأول مرة مع (~ 50mL) ثم 80 ٪ من الإيثانول (~ 50mL). تفكيك المكونات ، وتنظيف وتعقيم الزجاجة ، الغطاء ، وأنابيب مغلفة بورق الألمنيوم.
2. قياس نمو E. القولونية المستنسخون
- إزالة لوحات من 37 درجة مئوية الحاضنة. وإزالة جانبا الأغطية وألواح مكان على منصة التحميل مجلة المتوفرة مع RapidStak ، بحد أقصى قدره 25 لوحات.
ملاحظة : لوحة في اسفل كومة من سيكون أول واحد يجب أن تقرأ. تأكد من أن تتبع من أجل من لوحات ، والبرنامج لا يسجل هذا. - إزالة مجلة واحدة من Stak السريع ، تأكد من أنه فارغ ، ودفعها إلى المكدس لوحات يجب أن تقرأ. الاستيلاء عليها من قبل التعامل معها ، ويجب على جميع لوحات يتم تحميلها في المجلة. تحميل المجلة في RapidStak.
ملاحظة : مجلة لديه برغي صغير في الزاوية التي تشير الزاوية الآبار A1 من لوحات يجب أن تذهب. والمجلة الوحيدة في جبل RapidStak في اتجاه واحد. - فتح البرنامج RE SkanIt على الكمبيوتر متصلا الآلات. حدد "الدورة الجديدة" وتسميته بشكل مناسب. اختر "طابق سفلي كورنينج 384 جيدا لوحة" كنوع لوحة.
- في مجال "تخطيط لوحة" ، حدد "معالج" الزر ، واختر إضافة إلى 384 لوحة المجهولة لديك.
- في المنطقة "البروتوكول" ، حدد "حسنا حلقة" الخيار ، والدخول في 384 بئرا. وسوف "حسنا حلقة" أيقونة تظهر في شجرة التدفق على الجانب الأيسر من الشاشة. حدد رمز وانقر لإضافة "قياس مضوائية". تعيين إلى قراءة في ل 600Nm.
- حفظ البروتوكول الخاص مع اسم فريد ، وأغلق البرنامج RE SkanIt.
- على الكمبيوتر ، افتح برنامج PolaraRS.
- على الصفحة الرئيسية وسوف يكون هناك جدول إدراج الصكوك متصلا الجهاز RapidStak. ينبغي أن يكون VarioSkan على الجانب الأيسر من هذا الجدول. تحت عنوان VarioSkan ، سيكون هناك اثنين من وصلات "؛ RunSession" و "احتضان". انقر على "RunSession" الخيار.
- ستظهر نافذة جديدة ، في إطار الفحص ، تظهر مع مخطط انسيابي في الوسط. حدد "RunSession" البند (يجب أن يكون البند الوحيد الحاضر). على الجانب الأيمن من الشاشة القائمة المنسدلةوسوف تظهر. العثور على اسم RE الخاص SkanIt حفظ تشغيلها في هذه القائمة.
ملاحظة : يبدو أن هناك أي ترتيب منطقي لهذه القائمة. انها ليست الأبجدي ، أو تاريخ الاضافة ، أو تتصل على الكمبيوتر حيث يتم حفظها على البروتوكول. هذا يعني أنك يجب أن ننظر من خلال البروتوكولات الجميع أمام الحقائق الخاصة بك ، والذي هو الألم. - انقر مرة واحدة قمت بتحديد البروتوكول الخاص بك ، في الزاوية اليمنى العليا "تشغيل هذا الاختبار".
- سوف يظهر مربع يطفو على السطح ، يطلب منك للدلالة التي مجلة لاستخدامها كمصدر ، والتي مجلة فارغ. انخفاض مربع على الشاشة يناظر مجلة الجبهة. [اختياري : ويطلب منك إدخال عدد من لوحات حملت لتحديد تقدير لكمية الوقت الذي ستستغرقه. هذا التقدير هو عادة بعيدا.]
- ضمان رفض كل من وRapidStak VarioSkan المعنية ، ثم اضغط على "موافق".
- سيتم تلقائيا تحميل RapidStak لوحات الخاص في قارئ لوحة ، والسماح لقياسات مستمرة لوحات. لقراءة لوحات تأخذ ما يقرب من 25 50 دقيقة.
ملاحظة : من المستحسن لمراقبة التحميل طبق لأول مرة في VarioSkan لضمان التوافق السليم للآلات. إذا لم يتم تحميل RapidStak القارئ وحة صحيح ، واستخدام "وقفة هذا الاختبار" الموجود في الزاوية العليا اليمنى من نافذة PolaraRS. - وبمجرد الانتهاء من قراءة كل VarioSkan لوحات ، وإزالة مجلة الكامل ووضعه على منصة التحميل مجلة. ارفع المستطيل الخارجي للمنصة ، ومجلة ينبغي إيقاف الشريحة ، وترك لوحات واقفا في كومة في الوسط. استبدال لوحات لالأغطية المناسبة.
3. إضافة إلى كل ميكس الفحص بلايت
- إعداد مقايسة باستخدام مزيج الأسهم 10X ج ابحث مزيج من تحلل (10 ٪ تريتون X - 100 ، RIS 100mM ، 10MM EDTA) في 50mM العازلة اسيتات البوتاسيوم عند pH 5.5. إعداد المخزون تصل إلى الركيزة DNP - cellobioside 75mg/mL في DMSO ، والتأكد من يذوب تماما الركيزة. إضافة DNP - cellobioside حل لخلط الأوراق المالية مقايسة إلى التركيز النهائي لل0.1mg/mL. وسوف تستخدم كل لوحة 20mL ما يقرب من الحل ، بالإضافة إلى إجراء 50mL إضافية للسماح لحجم القتلى.
ملاحظة : DNP - Cellobioside لا يذوب بسهولة في الماء ، وذلك في حل DMSO يزيد من الذوبان. وجود DMSO في الحل النهائي مقايسة ليس له أي آثار يمكن ملاحظتها. - إعداد qFill3 وتعليمات الشركة الصانعة في زجاجة مع وسائل الاعلام التابعة لمشعب عبر أنابيب معقمة. البرنامج الذي لكمية مناسبة من وسائل الإعلام ، وتعيين لملء حجم 45uL في كل بئر.
- تطهير الهواء من الأنابيب المتعددة وباستخدام ميزة تطهير الروبوت حتى وسائل الاعلام المرئية والقادمة من كل طرف من الجوانب.
- إضافة إلى مزيج مقايسة كل لوحة باستخدام qFill3. كل لوحة يستغرق نحو 20 ثانية لملء الفراغ.
- مرة واحدة يضاف مزيج مقايسة ، احتضان لوحات في 37 في مربع الرطوبة 12-16 درجة مئوية لساعات.
ملاحظة : يتم إضافة أكثر من الحضانة في لوحات أخرى على مزيج مقايسة سوف يسبب تبخر في الآبار الخارجي للوحة ، مما أسفر عن ارتفاع قراءات الامتصاصية من ينظر لآبار في الداخل. ويمكن تعويض ذلك من خلال احتضان لوحات في غرفة الرطوبة.
4. القراءة من امتصاص المستنسخون اختبر
- إزالة لوحات من 37 درجة مئوية الحاضنة. وإزالة جانبا الأغطية وألواح مكان على منصة التحميل مجلة المتوفرة مع RapidStak ، بحد أقصى قدره 25 لوحات.
ملاحظة : لوحة في اسفل كومة من سيكون أول واحد يجب أن تقرأ. تأكد من أن تتبع من أجل من لوحات ، والبرنامج لا يسجل هذا. - إزالة مجلة واحدة من Stak السريع ، تأكد من أنه فارغ ، ودفعها إلى المكدس لوحات يجب أن تقرأ. الاستيلاء عليها من قبل التعامل معها ، ويجب على جميع لوحات يتم تحميلها في المجلة. تحميل المجلة في RapidStak.
ملاحظة : مجلة لديه برغي صغير في الزاوية التي تشير الزاوية الآبار A1 من لوحات يجب أن تذهب. والمجلة الوحيدة في جبل RapidStak في اتجاه واحد. - فتح البرنامج RE SkanIt على الكمبيوتر متصلا الآلات. حدد "الدورة الجديدة" وتسميته بشكل مناسب. اختر "طابق سفلي كورنينج 384 جيدا لوحة" كنوع لوحة.
- في مجال "تخطيط لوحة" ، حدد "معالج" الزر ، واختر إضافة إلى 384 لوحة المجهولة لديك.
- في المنطقة "البروتوكول" ، حدد "حسنا حلقة" الخيار ، والدخول في 384 بئرا. وسوف "حسنا حلقة" أيقونة تظهر في شجرة التدفق على الجانب الأيسر من الشاشة. حدد رمز وانقر لإضافة "قياس مضوائية". تعيين إلى قراءة في 400nm.
- حفظ البروتوكول الخاص مع اسم فريد ، وأغلق البرنامج RE SkanIt.
- على الكمبيوتر ، افتح برنامج PolaraRS.
- على الصفحة الرئيسية وسوف يكون هناك جدول إدراج الصكوك متصلا الجهاز RapidStak. ينبغي أن يكون VarioSkan على الجانب الأيسر من هذا الجدول. تحت عنوان VarioSkan ، سيكون هناك اثنين من وصلات "؛ RunSession" وIncubat "ه ". انقر على" RunSession "الخيار.
- ستظهر نافذة جديدة ، في إطار الفحص ، تظهر مع مخطط انسيابي في الوسط. حدد "RunSession" البند (يجب أن يكون البند الوحيد الحاضر). على الجانب الأيمن من الشاشة والقائمة المنسدلة تظهر. العثور على اسم RE الخاص SkanIt حفظ تشغيلها في هذه القائمة.
- انقر مرة واحدة قمت بتحديد البروتوكول الخاص بك ، في الزاوية اليمنى العليا "تشغيل هذا الاختبار".
- سوف يظهر مربع يطفو على السطح ، يطلب منك للدلالة التي مجلة لاستخدامها كمصدر ، والتي مجلة فارغ. انخفاض مربع على الشاشة يناظر مجلة الجبهة. [اختياري : ويطلب منك إدخال عدد من لوحات حملت لتحديد تقدير لكمية الوقت الذي ستستغرقه. هذا التقدير هو عادة بعيدا.]
- ضمان رفض كل من وRapidStak VarioSkan المعنية ، ثم اضغط على "موافق"
- سيتم تلقائيا تحميل RapidStak لوحات الخاص في قارئ لوحة ، والسماح لقياسات مستمرة لوحات.
ملاحظة : من المستحسن لمراقبة التحميل طبق لأول مرة في VarioSkan لضمان التوافق السليم للآلات. إذا لم يتم تحميل RapidStak القارئ وحة صحيح ، واستخدام "وقفة هذا الاختبار" الموجود في الزاوية العليا اليمنى من نافذة PolaraRS. - وبمجرد الانتهاء من قراءة كل VarioSkan لوحات ، وإزالة مجلة الكامل ووضعه على منصة التحميل مجلة. ارفع المستطيل الخارجي للمنصة ، ومجلة ينبغي إيقاف الشريحة ، وترك لوحات واقفا في كومة في الوسط. يمكن التخلص من لوحات وفقا لإجراءات المختبر الخاص بك.
- لتصدير قراءات الامتصاصية ، RE SkanIt البرمجيات مفتوحة ، واختيار "فتح ملف موجود".
- حدد الدليل حيث قمت بحفظ جلسة العمل الخاصة بك ، وضرب "+" رمز لتوسيع القائمة وتحت عنوان البند سيتم خيارات المسمى "حاوية 1" إلى "N الحاويات" اعتمادا على عدد من لوحات. حدد لوحة أول من تحليلها.
- في شريط القائمة في الجزء العلوي من الصفحة ، حدد "معالجة البيانات> تقرير / التصدير"
- اختر الخيارات المطلوبة للتصدير.
ملاحظة : أنا عادة حدد "تخطيط لوحة" و "مضوائية" بيانات للتصدير. - انقر على زر "عرض التقرير" ثم "ملف> حفظ". اختر الدليل المطلوب. تنسيق الإخراج هو جدول بيانات Microsoft Excel
5. ممثل النتائج
ويرد مثال على قراءات الامتصاصية من 384 لوحة واحدة بشكل جيد يحتوي على استنساخ إيجابية في الشكل 2. استنساخ الإيجابية تظهر ارتفاعا ملحوظا في أكثر من أولئك الذين لا الامتصاصية معربا عن النشاط سلولاز. يمكن أن الاختلافات في وقت الفحص ، والموقع بشكل جيد على لوحة ، أو تركيز DNP (قد تكون أدخلت من خلال تصفية الامم المتحدة بحل DNP) تؤثر على قراءات الامتصاصية مطلقة. قراءات الامتصاصية النسبي ، مثل الفرق في الامتصاصية فوق متوسط أو متوسط لوحة العمود ، هي وسيلة قوية لتحديد أكثر إيجابية سلولاز الحيوانات المستنسخة.
بعد التعرف على الحيوانات المستنسخة ايجابية من لوحات المكتبة ، فمن المستحسن لتكرار كل الحيوانات المستنسخة الإيجابية في لوحة جديدة لفحص ثانوي. هذا يزيل آثار الناشئة عن اختلاف موقع البئر أو لوحة ، ويسمح للمقارنة مباشرة بين الحيوانات المستنسخة أكثر إيجابية.
الشكل 1. الرسم البياني للمقايسة الإنتاجية العالية لمكتبة metagenomic المستنسخة في E. القولونية وتخزينها في -80 درجة مئوية.
الشكل 2. امتصاص قراءات من 384 لوحة كذلك يحتوي على استنساخ إيجابية. يمكن التعرف على الحيوانات المستنسخة إيجابية سلولاز الامتصاصية التي زادت بشكل كبير خلال استنساخ سلبية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
شاشة إنتاجية عالية للكشف السريع للنشاط cellulolytic من الجينوم إدراج مكتبة كبيرة metagenomic الحمض النووي التي أعرب عنها في E. يوصف القولونية في هذا البروتوكول. هذا الأسلوب هو تحسنا خلال مقايسة الأحمر CMC / الكونغو استخداما في الأدبيات. هو حل قائم ، ويسمح لأحد وعاء الفحص الكيمياء في لوحات - 384 جيدا ، مع الإخراج النهائي قراءات الامتصاصية من قارئ لوحة تسمح للتحليل الكمي. أتمتة كل خطوة من هذه العملية تسمح للفرز غير خاضعة للرقابة من أكثر من 25 لوحات 384 جيدا للساعة الواحدة. يمكن أن تكون البيانات التي تم تصديرها بسهولة من البرامج في جدول بيانات Microsoft Excel ، مما يسمح للتحليل أو المعالجة من قبل طرف ثالث البرمجيات.
واحد الحد من هذا الاختبار موجود في إمكانية التعبير عن البروتينات الخارجية في E. القولونية المضيف. مكتبة تحتوي على الحمض النووي من metagenomic كائنات مختلفة وكثيرة ، لا يمكن إلا أن مجموعة فرعية من الذي سيكون معترف بها من قبل E. القولونية النسخ / آلات الترجمة. حتى عندما أعرب ، قد منتجات الجين الخارجية لن تحقق وظيفة نتيجة للطي غير لائق ، تجهيز ، أو عدم كفاية مستويات التعبير. يمكن أن تكون هذه القيود جزئيا من خلال استخدام نظم التحكم في نسخ ، كما رأينا في السابق وظيفية دراسات فرز metagenomic 12. fosmid استخدام التحكم نسخة pCC1 هنا يسمح تحريض من خلال إضافة محفز L - أرابينوز ، ويزيد عدد النسخ من واحدة ، لتصل إلى 100 نسخة في كل خلية 13. ويمكن تحسين هذه النظم نتائج الشاشات على أساس النشاط من خلال تمكين النمو نسخة واحدة للاستقرار مع الحث اللاحقة لزيادة النشاط.
الركيزة 2،4 - DNP - Cellobioside المستخدمة في الشاشة لدينا ليست متاحة تجاريا من الموردين ، ولكن يمكن شراؤها ركائز مماثلة. سيغما الدريخ تقدم 2 - nitrophenyl (القط رقم N4764) و 4 - nitrophenyl (القط رقم N5759) cellobiosides. ويمكن الاضطلاع على الشاشة كما هو موضح عامة مع هذه ركائز ، ولكن ستكون هناك حاجة بعض التعديلات. هذه الفينولات أحادية استبداله يكون أعلى القيم الباكاف الحمضية ، نحو 7.2 ، مقارنة DNP ، والتي تبلغ حوالي 4. وقد تم الإبلاغ عن الرقم الهيدروجيني الأمثل للنشاط سلولاز تتراوح بين 4،5-6،0 درجة الحموضة 14 ، 15. استخدام DNP - C يتيح للمقايسة التي يتعين الاضطلاع بها في ظروف الأس الهيدروجيني الأمثل ، مما يسمح لتسهيل تحديد السليلوزات. إضافة إلى ذلك ، غليكوزيد دى استبداله هو أكثر بكثير من الآخرين على رد الفعل ، والسماح للكشف عن السليلوزات أكثر ترددا. وبالتالي ، فقد سمح للاستخدام DNP - cellobioside عن الشاشة أكثر قوة وحساسية من سيكون متاحا مع ركائز التجارية.
ومن الجدير بالذكر أنه يمكن استخدام هذه الشاشة للكشف عن أي الانزيمات المرتبطة مع الركيزة اللونية أو fluorometric. السليلوزات هي انزيم مستقرة ونشطة ، مثالية لتطوير والتحسين الأولي من المعلمات الفرز. النهج العام المقدمة هنا هو أداة قوية لفحص المكتبات metagenomic للتطبيقات على حد سواء الأكاديمية والصناعية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
فإن الكتاب أود أن أشكر الدكتور ستيف الكاهل وتشن هونغ مينغ لتوفير DNP - Cellobioside الركيزة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| qPix2 | Genetix | With 384-pin gridding head | |
| qFill3 | Genetix | With 384-well manifold | |
| Varioskan | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ||
| RapidStak | Thermo Fisher Scientific, Inc. | Connected to Varioskan | |
| Micro90 Detergent | Cole-Parmer | 18100-00 | Diluted to 2% in water |
| Ethanol | Major Lab Supplier | Diluted to 80% in water | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | 12.5mg/mL in ethanol |
| LB broth, Miller | Fisher Scientific | BP1426-2 | 25g/L, autoclaved |
| 384-well flat bottom plates | Corning | 3680 | |
| L-(+)-Arabinose | Sigma-Aldrich | A3256 | 100mg/mL in water |
| Potassium Acetate | Fisher Scientific | P171 | 50mM in water, autoclaved, adjusted to pH 5.5 with HCl |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151 | |
| Trizma hydrochloride | Sigma-Aldrich | T3253 | In TE buffer solution, 100mM |
| EDTA disodium salt | Sigma-Aldrich | E5134 | In TE buffer solution, 10mM |
| 2,4-dinitrophenyl cellobioside | Provided by Dr. Steve Withers, UBC | ||
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418 |
References
- Rubin, E. M. Genomics of cellulosic biofuels. Nature. 454, 841-845 (2008).
- Voget, S., Steele, H. L., Streit, W. R. Characterization of a metagenome derived halotolerant cellulase. J. Biotechnol. 126, 26-36 (2006).
- Duan, C. J. Isolation and partial characterization of novel genes encoding acidic cellulases from metagenomes of buffalo rumens. J. Appl. Microbiol. 107, 245-256 (2009).
- Zhang, Y. H. P. Outlook for cellulase improvement: Screening and selection strategies. Biotech. Advances. 24, 452-481 (2006).
- Teather, R. M., Wood, P. J. Use of congo red-polysaccharide interactions in enumeration and characterization of cellulolytic bacteria from the bovine rumen. Appl. And Environ. Microbiol. 43, 777-780 (1982).
- Sharrock, K. R. Cellulase assay methods: a review. J. Biochem and Biophys Methods. 17, 81-106 (1988).
- Kasana, R. C., Salwan, R., Dhar, H., Dutt, S., Gulati, A. A rapid and easy method for detection of microbial cellulases on agar plates using Gram's Iodine. Curr. Microbiology. 57, 503-507 (2008).
- Huang, J. S., Tang, J. Sensitive assay for cellulase and dextranase. Anal. Biochem. 73, 369-377 (1976).
- Tull, D., Withers, S. G. Mechanisms of cellulases and xylanases: A detailed kinetic study of the exo-beta-1,4-glycanase from Cellulomonas fimi. Biochemistry. 33, 6363-6370 (1994).
- Martinez, A., Bradley, A. S., Waldbauer, J. R., Summons, R. E., DeLong, E. F. Proteorhodopsin photosystem gene expression enables photophosphorylation in a heterologous host. PNAS. 104, 5590-5595 (2007).
- Taupp, M., Lee, S., Hawley, A., Yang, J., Hallam, S. J. Large Insert Environmental Genomic Library Production. J Vis Exp. , (2009).
- Martinez, A., Tyson, G. W., DeLong, E. F. Widespread known and novel phosphonate utilization pathways in marine bacteria revealed by functional screening and metagenomic analyses. Environ Microbiol. 12, 222-238 (2010).
- Wild, J., Hradecna, Z., Szybalski, W. Conditionally amplifiable BACs: Switching from single-copy to high-copy vectors and genomic clones. Genome Research. 12, 1434-1444 (2002).
- Johnson, E. A. Sacchirification of complex cellulosic substrates by the cellulase system from Clostridium thermocellum. Appl Environ Microbiology. 43, 1125-1132 (1982).
- Stutzenberger, F. J. Cellulase Production by Thermomonospora curvata isolated from municipal solid waste compost. Appl Environ Microbiol. 22, 147-152 (1971).
