Summary
इस प्रोटोकॉल के एक metagenomic Escherichia कोलाई में व्यक्त पुस्तकालय से cellulolytic गतिविधि के लिए एक उच्च throughput स्क्रीन का वर्णन करता है. स्क्रीन आधारित है और अत्यधिक स्वचालित समाधान है, और एक absorbance के माप के रूप में अंतिम readout के साथ 384 अच्छी तरह से microplates में एक बर्तन रसायन का उपयोग करता है.
Abstract
सेलूलोज़, ग्रह पर कार्बनिक कार्बन का सबसे प्रचुर स्रोत, जैव ईंधन उत्पादन 1 पर बढ़ते जोर देने के साथ व्यापक औद्योगिक अनुप्रयोगों है. रासायनिक तरीकों को संशोधित करने या सेलूलोज़ नीचा आम तौर पर मजबूत एसिड और उच्च तापमान की आवश्यकता है. जैसे, enzymatic तरीकों bioconversion प्रक्रिया में प्रमुख बन गए हैं. जबकि जीवाणु और कवक आइसोलेट्स से सक्रिय cellulases की पहचान कुछ हद तक प्रभावी किया गया है, प्रकृति में रोगाणुओं के विशाल बहुमत प्रयोगशाला खेती का विरोध. पर्यावरण जीनोमिक metagenomic स्क्रीनिंग दृष्टिकोण के रूप में भी जाना जाता है उपन्यास bioconversion एंजाइमों के लिए खोज में खेती अंतर को पूरा करने में महान वादा है. Metagenomic स्क्रीनिंग दृष्टिकोण सफलतापूर्वक वातावरण से उपन्यास cellulases बरामद 2 मिट्टी, भैंस रूमेण 3 और हिंद - पेट दीमक 4 का उपयोग carboxymethylcellulose (सीएमसी) अगर कांगो लाल रंग (teather और 5 लकड़ी की विधि के आधार पर) के साथ दाग प्लेटों के रूप में विविध के रूप में. हालांकि, सीएमसी विधि throughput में सीमित है, मात्रात्मक और शोर अनुपात 6 के लिए नहीं है एक कम संकेत प्रकट होता है. अन्य तरीकों 7,8 सूचित किया गया है, लेकिन प्रत्येक उपयोग अगर परख थाली आधारित है, जो बड़े डालने जीनोमिक पुस्तकालयों के उच्च throughput स्क्रीनिंग लिए अवांछनीय है. यहाँ हम एक cellulase chromogenic (DNP) dinitrophenol cellobioside 9 सब्सट्रेट का उपयोग कर गतिविधि के लिए समाधान आधारित स्क्रीन उपस्थित थे . हमारे पुस्तकालय pCC1 प्रतिलिपि प्रतिलिपि संख्या 10 प्रेरण के माध्यम से परख संवेदनशीलता को बढ़ाने के लिए fosmid नियंत्रण में क्लोन किया गया था. विधि अंतिम एक absorbance के माप के रूप में प्रदान की readout के साथ 384 अच्छी तरह से microplates में एक बर्तन रसायन का उपयोग करता है. इस readout मात्रात्मक, संवेदनशील और अप करने के प्रति दिन 100X 384 अच्छी तरह प्लेटें एक तरल और संलग्न stacking प्रणाली के साथ प्लेट पाठक हैंडलर का उपयोग करने के लिए throughput के साथ स्वचालित है.
Protocol
इस प्रोटोकॉल शुरू करने से पहले, आप अपने metagenomic एक 384 अच्छी तरह से थाली स्वरूप में संग्रहीत पुस्तकालय की आवश्यकता होगी. हमारे अध्ययन में, हम T1 प्रतिरोधी फेज EPI300 T1 TransforMax आर ई के साथ संयोजन में pCC1 प्रतिलिपि नियंत्रण fosmid सदिश का इस्तेमाल पुस्तकालय मेजबान और संग्रहीत ° -80 सी 11 पर हमारी प्लेटों के रूप में कोलाई कोशिकाओं.
1. Metagenomic लाइब्रेरी प्लेट्स की प्रतिकृति
- डीफ्रोस्ट 37 पर अपने पुस्तकालय का युक्त प्लेटें सी लगभग 20 मिनट के लिए जब तक °, या सभी कुओं thawed हैं.
- QPix2 पर यूवी प्रकाश स्टरलाइज़ सुविधा का उपयोग 15 मिनट के लिए रोबोट बाँझ.
- Chloramphenicol के साथ एक 500ml अभिकर्मक बोतल में 100ug/mL पर एक 12.5ug/mL और arabinose के अंतिम एकाग्रता में लेग शोरबा तैयार करें. प्रत्येक थाली लगभग 20ml उपयोग, प्लस एक अतिरिक्त 50ml बनाने मृत मात्रा के लिए अनुमति देने के.
- मीडिया बोतल बाँझ टयूबिंग के माध्यम से कई गुना करने के लिए संलग्न के साथ प्रति निर्माता के निर्देशों के रूप में qFill3 सेट. यह मीडिया की उचित राशि के लिए कार्यक्रम, और यह निर्धारित करने के लिए प्रत्येक कुएं में एक 45uL मात्रा को भरने के लिए.
- टयूबिंग और रोबोट की शुद्ध सुविधा का उपयोग कर जब तक मीडिया कई गुना के प्रत्येक पिन से आने के लिए दिखाई है कई गुना से हवा पर्ज.
- लेग qFill3 का उपयोग मीडिया के साथ प्लेटों के वांछित संख्या भरें. प्रत्येक थाली के लगभग 20 सेकंड भरने लेता है.
- लोड qPix2 रोबोट के उपयुक्त क्षेत्रों में पुस्तकालय प्लेटें और ताजा प्लेटें. पीछे स्नान में 2 Micro90%, मध्य स्नान में आसुत जल autoclaved, सामने स्नान में 80% इथेनॉल, उचित अभिकर्मकों के साथ सफाई स्नान भरें.
- QPix2 के "नकल" कार्यक्रम का उपयोग करें. सॉफ्टवेयर में उपयुक्त सिर, और स्रोत प्लेटें और गंतव्य प्लेटों की संख्या प्रकार का चयन करें. इसके अलावा प्रत्येक स्नान में अनुकरण, आमतौर पर 6 चक्र के बीच साफ करने के लिए सिर सेट पर्याप्त है. मशीन की क्षमता एक बार में 10 प्लेटों है, और यह लगभग 15 मिनट लगते हैं एक 384 पिन सिर (या एक 96 पिन के सिर के साथ लगभग 50 मिनट) के साथ उन सभी को दोहराने.
नोट: वहाँ एक विकल्प स्रोत हिलाओ "या" गंतव्य हिलाओ "है. यह उपयोग करने के लिए के रूप में समस्याओं को पहले हमारे रोबोट उन्हें का उपयोग कर के साथ नहीं हुई है इन विकल्पों की सिफारिश की है. - एक बार प्लेटें दोहराया जाता है, 37 ° C आर्द्रता बॉक्स में 24 घंटे के लिए प्लेटें बढ़ने. क्योंकि हम arabinose के अलावा के साथ fosmid के एक उच्च प्रतिलिपि संख्या उत्प्रेरण हैं, क्लोन करने के लिए गैर प्रेरित क्लोन की तुलना में धीमी विकास करते हैं. -80 डिग्री सेल्सियस के लिए पुस्तकालय प्लेटें लौटें
नोट: एक नमी बॉक्स में ऊष्मायन यह सुनिश्चित करता है मीडिया के वाष्पीकरण प्लेटों के किनारे पर कुओं में घटित नहीं करता है, सभी कुओं के लिए एक समान वातावरण रखने. - पहली बार यह पानी (50ml ~) और फिर 80% इथेनॉल (50ml ~) के साथ purging द्वारा qFill3 रोबोट साफ़. घटकों को अलग करना, और स्वच्छ और बोतल, ढक्कन, और टयूबिंग एल्यूमीनियम पन्नी में लिपटे आटोक्लेव.
2. ई. के विकास को मापने कोलाई क्लोन
- से 37 ° सी इनक्यूबेटर प्लेटें निकालें. निकालें और तरफ पत्रिका लोड हो रहा है RapidStak के साथ प्रदान की मंच पर lids, और जगह प्लेटें सेट, 25 प्लेटों की एक अधिकतम करने के लिए.
नोट: ढेर के नीचे थाली पहले पढ़ा जा जाएगा. प्लेटों के आदेश का ट्रैक रखने के लिए, के रूप में सॉफ्टवेयर के इस रिकॉर्ड नहीं करता है सुनिश्चित करें. - रैपिड Stak से एक पत्रिका निकालें सुनिश्चित करने के लिए, यह खाली है, और इसे पढ़ा जा प्लेटों के ढेर पर धक्का. इसे संभाल ले लो, और प्लेटें सभी पत्रिका में लोड किया जाना चाहिए. RapidStak में पत्रिका लोड.
नोट: पत्रिका denoting जो कोने प्लेटों के A1 कुओं जाना चाहिए कोने में एक छोटा सा स्क्रू है. पत्रिका केवल एक ही ओरिएंटेशन में RapidStak में आरोहित करेगा. - मशीनों को जुड़ा कंप्यूटर पर SkanIt आरई प्रोग्राम खोलें. "नई सत्र" का चयन करें और यह उचित नाम है. "Corning फ्लैट 384 अच्छी तरह से नीचे की थाली" थाली प्रकार के रूप में चुनें.
- "प्लेट लेआउट क्षेत्र में," जादूगर "बटन का चयन करें, और इसे चुनने के लिए अपनी थाली में 384 unknowns जोड़ने.
- "प्रोटोकॉल" क्षेत्र में, "ठीक लूप" विकल्प का चयन करें, और 384 कुओं के लिए दर्ज करें. "ठीक लूप" आइकन प्रवाह पेड़ में स्क्रीन के बाएं हाथ की ओर दिखाई देगा. चिह्न का चयन करें और क्लिक करें "भामिति मापन" जोड़ने. यह सेट 600nm पर पढ़ने.
- एक अनूठा नाम के साथ अपनी प्रोटोकॉल सहेजें, और SkanIt आरई कार्यक्रम बंद.
- कंप्यूटर पर, PolaraRS कार्यक्रम खुला.
- मुख्य पृष्ठ पर RapidStak डिवाइस से जुड़े उपकरणों लिस्टिंग तालिका हो जाएगा. VarioSkan इस तालिका के बाईं ओर पर किया जाना चाहिए. VarioSkan शीर्षक के तहत, वहाँ दो लिंक किया जाएगा, "RunSession" और "सेते हैं". "RunSession" विकल्प पर क्लिक करें.
- एक नई विंडो, परख खिड़की, बीच में एक प्रवाह संचित्र के साथ दिखाई देगा. "RunSession" आइटम (यह केवल आइटम मौजूद होना चाहिए) का चयन करें. स्क्रीन के दाईं ओर ड्रॉप - डाउन मेनू मेंदिखाई देगा. अपने बचाया SkanIt इस मेनू में चलाने के आरई का नाम खोजें.
नोट: वहाँ इस मेनू के लिए कोई तर्कसंगत आदेश देने से प्रतीत होता है. यह वर्णमाला, नहीं है, या दिनांक के आधार पर कहा, या, जहां कंप्यूटर पर प्रोटोकॉल सहेजा जाता है संबंधित है. इसका मतलब है कि आप अपने खुद को खोजने से पहले सभी प्रोटोकॉल, जो एक दर्द है के माध्यम से देखना चाहिए. - एक बार जब आप अपने प्रोटोकॉल का चयन किया है, ऊपरी दाएँ कोने में, क्लिक करें "इस परख भागो".
- एक बॉक्स पॉप अप, तो आप पूछ निरूपित जो पत्रिका के स्रोत के रूप में उपयोग करने के लिए होगा, और जो पत्रिका खाली है. स्क्रीन पर निचले बॉक्स सामने पत्रिका के लिए मेल खाती है. वैकल्पिक [: यह पूछता है तुम इसे ले जाएगा समय की राशि के लिए एक अनुमान का निर्धारण करने के लिए लोड प्लेटों की संख्या दर्ज करें. यह अनुमान सामान्य रास्ता बंद.]
- सुनिश्चित RapidStak और VarioSkan दोनों पर बदल रहे हैं, और प्रेस "ठीक है".
- RapidStak प्लेट रीडर में स्वत: अपनी प्लेट लोड होगा, प्लेटों के निरंतर माप के लिए अनुमति देता है. 25 प्लेटें पढ़ने के लिए लगभग 50 मिनट लगते हैं.
नोट: यह VarioSkan में पहली प्लेट लोड हो रहा है निरीक्षण करने के लिए मशीनों के उचित संरेखण को सुनिश्चित करने के लिए सिफारिश की है. यदि RapidStak प्लेट पाठक लोड नहीं ठीक करता है, PolaraRS विंडो के ऊपरी दाएँ कोने में "रोकें इस परख" बटन का उपयोग करें. - एक बार VarioSkan सभी प्लेटों को पढ़ने के लिए किया जाता है, पूर्ण पत्रिका हटाने और यह पत्रिका लोड हो रहा है मंच पर जगह है. मंच के बाहरी आयत लिफ्ट, और पत्रिका बंद स्लाइड, प्लेटों के बीच में एक ढेर में खड़े छोड़ चाहिए. उपयुक्त प्लेटें lids बदलें.
3. परख मिक्स के प्रत्येक प्लेट के अलावा
- परख 50mm पोटेशियम एसीटेट बफर में 5.5 पीएच lysis मिश्रण के premade 10x शेयर (10% X-100 ट्राइटन, आरआईएस 100mm, 10mm EDTA) का उपयोग कर मिश्रण तैयार करें. 75mg/mL DMSO में DNP - cellobioside सब्सट्रेट के एक शेयर को तैयार है, यकीन है कि सब्सट्रेट पूरी तरह से भंग है बनाने. 0.1mg/mL की परख मिश्रण करने के लिए एक अंतिम एकाग्रता DNP - cellobioside शेयर समाधान जोड़ें. प्रत्येक थाली लगभग 20ml समाधान का उपयोग, प्लस एक अतिरिक्त 50ml बनाने मृत मात्रा के लिए अनुमति देने के.
नोट: DNP Cellobioside आसानी से पानी में घुलनशील नहीं है, इसलिए DMSO में भंग विलेयता बढ़ जाती है. अंतिम परख समाधान में DMSO की उपस्थिति में कोई प्रत्यक्ष प्रभाव है. - मीडिया बोतल बाँझ टयूबिंग के माध्यम से कई गुना करने के लिए संलग्न के साथ प्रति निर्माता के निर्देशों के रूप में qFill3 सेट. यह मीडिया की उचित राशि के लिए कार्यक्रम, और यह निर्धारित करने के लिए प्रत्येक कुएं में एक 45uL मात्रा को भरने के लिए.
- टयूबिंग और रोबोट की शुद्ध सुविधा का उपयोग कर जब तक मीडिया कई गुना के प्रत्येक पिन से आने के लिए दिखाई है कई गुना से हवा पर्ज.
- प्रत्येक प्लेट का उपयोग कर qFill3 परख मिश्रण जोड़ें. प्रत्येक थाली के लगभग 20 सेकंड भरने लेता है.
- एक बार परख मिश्रण में जोड़ा जाता है, 37 प्लेटें सेते ° एक नमी बॉक्स में 12-16 घंटे के लिए सी.
नोट: परख मिश्रण एक बार प्लेटों के ओवर - ऊष्मायन जोड़ा प्लेट के बाहरी कुओं में वाष्पीकरण के कारण, उच्च absorbance रीडिंग से अंदर कुओं के लिए देखा उपज. यह एक आर्द्रता चैम्बर में प्लेटें incubating द्वारा ऑफसेट किया जा सकता है है.
4. Assayed क्लोन के absorbance पढ़ना
- से 37 ° सी इनक्यूबेटर प्लेटें निकालें. निकालें और तरफ पत्रिका लोड हो रहा है RapidStak के साथ प्रदान की मंच पर lids, और जगह प्लेटें सेट, 25 प्लेटों की एक अधिकतम करने के लिए.
नोट: ढेर के नीचे थाली पहले पढ़ा जा जाएगा. प्लेटों के आदेश का ट्रैक रखने के लिए, के रूप में सॉफ्टवेयर के इस रिकॉर्ड नहीं करता है सुनिश्चित करें. - रैपिड Stak से एक पत्रिका निकालें सुनिश्चित करने के लिए, यह खाली है, और इसे पढ़ा जा प्लेटों के ढेर पर धक्का. इसे संभाल ले लो, और प्लेटें सभी पत्रिका में लोड किया जाना चाहिए. RapidStak में पत्रिका लोड.
नोट: पत्रिका denoting जो कोने प्लेटों के A1 कुओं जाना चाहिए कोने में एक छोटा सा स्क्रू है. पत्रिका केवल एक ही ओरिएंटेशन में RapidStak में आरोहित करेगा. - मशीनों को जुड़ा कंप्यूटर पर SkanIt आरई प्रोग्राम खोलें. "नई सत्र" का चयन करें और यह उचित नाम है. "Corning फ्लैट 384 अच्छी तरह से नीचे की थाली" थाली प्रकार के रूप में चुनें.
- "प्लेट लेआउट क्षेत्र में," जादूगर "बटन का चयन करें, और इसे चुनने के लिए अपनी थाली में 384 unknowns जोड़ने.
- "प्रोटोकॉल" क्षेत्र में, "ठीक लूप" विकल्प का चयन करें, और 384 कुओं के लिए दर्ज करें. "ठीक लूप" आइकन प्रवाह पेड़ में स्क्रीन के बाएं हाथ की ओर दिखाई देगा. चिह्न का चयन करें और क्लिक करें "भामिति मापन" जोड़ने. यह सेट 400nm पर पढ़ने.
- एक अनूठा नाम के साथ अपनी प्रोटोकॉल सहेजें, और SkanIt आरई कार्यक्रम बंद.
- कंप्यूटर पर, PolaraRS कार्यक्रम खुला.
- मुख्य पृष्ठ पर RapidStak डिवाइस से जुड़े उपकरणों लिस्टिंग तालिका हो जाएगा. VarioSkan इस तालिका के बाईं ओर पर किया जाना चाहिए. VarioSkan शीर्षक के तहत, वहाँ दो लिंक किया जाएगा, "RunSession" और "Incubatई RunSession "विकल्प" पर क्लिक करें. "
- एक नई विंडो, परख खिड़की, बीच में एक प्रवाह संचित्र के साथ दिखाई देगा. "RunSession" आइटम (यह केवल आइटम मौजूद होना चाहिए) का चयन करें. स्क्रीन के दाईं ओर ड्रॉप - डाउन मेनू दिखाई देगा. अपने बचाया SkanIt इस मेनू में चलाने के आरई का नाम खोजें.
- एक बार जब आप अपने प्रोटोकॉल का चयन किया है, ऊपरी दाएँ कोने में, क्लिक करें "इस परख भागो".
- एक बॉक्स पॉप अप, तो आप पूछ निरूपित जो पत्रिका के स्रोत के रूप में उपयोग करने के लिए होगा, और जो पत्रिका खाली है. स्क्रीन पर निचले बॉक्स सामने पत्रिका के लिए मेल खाती है. वैकल्पिक [: यह पूछता है तुम इसे ले जाएगा समय की राशि के लिए एक अनुमान का निर्धारण करने के लिए लोड प्लेटों की संख्या दर्ज करें. यह अनुमान सामान्य रास्ता बंद.]
- सुनिश्चित करें दोनों RapidStak और VarioSkan पर बदल रहे हैं, और प्रेस "ठीक"
- RapidStak प्लेट रीडर में स्वत: अपनी प्लेट लोड होगा, प्लेटों के निरंतर माप के लिए अनुमति देता है.
नोट: यह VarioSkan में पहली प्लेट लोड हो रहा है निरीक्षण करने के लिए मशीनों के उचित संरेखण को सुनिश्चित करने के लिए सिफारिश की है. यदि RapidStak प्लेट पाठक लोड नहीं ठीक करता है, PolaraRS विंडो के ऊपरी दाएँ कोने में "रोकें इस परख" बटन का उपयोग करें. - एक बार VarioSkan सभी प्लेटों को पढ़ने के लिए किया जाता है, पूर्ण पत्रिका हटाने और यह पत्रिका लोड हो रहा है मंच पर जगह है. मंच के बाहरी आयत लिफ्ट, और पत्रिका बंद स्लाइड, प्लेटों के बीच में एक ढेर में खड़े छोड़ चाहिए. प्लेटें अपनी प्रयोगशाला प्रक्रियाओं के अनुसार का निपटारा किया जा सकता है.
- Absorbance रीडिंग, खुले SkanIt आरई सॉफ्टवेयर, निर्यात और चुनें "किसी मौजूदा फ़ाइल खोलें".
- चुनें निर्देशिका है जहाँ आप अपने सत्र को बचाया, "+" आइकन मारा सूची का विस्तार करने के लिए और शीर्षक शीर्षक के अंतर्गत कंटेनर "एन" प्लेटों की संख्या पर निर्भर करता है "1 कंटेनर" लेबल विकल्प हो जाएगा. पहले थाली करने के लिए विश्लेषण किया जा चुनें.
- पृष्ठ के शीर्ष पर मेनू पट्टी में "डाटा प्रोसेसिंग> रिपोर्ट / निर्यात करें" का चयन करें
- निर्यात के लिए इच्छित विकल्प चुनें.
नोट: मैं आमतौर पर "प्लेट लेआउट" चुनें और निर्यात के लिए "भामिति" डेटा. - "रिपोर्ट देखें" और फिर "फ़ाइल सहेजें>" पर क्लिक करें. इच्छित निर्देशिका में चुनें. आउटपुट स्वरूप Microsoft Excel स्प्रेडशीट
5. प्रतिनिधि परिणाम
एक एकल 384 अच्छी तरह से एक सकारात्मक क्लोन युक्त थाली से absorbance रीडिंग का एक उदाहरण चित्रा 2 में दिखाया गया है. सकारात्मक क्लोन व्यक्त cellulase गतिविधि नहीं उन पर absorbance में एक उल्लेखनीय वृद्धि दिखा. परख समय में अंतर, थाली पर अच्छी तरह से स्थान, या DNP की एकाग्रता (संयुक्त राष्ट्र - भंग DNP फ़िल्टरिंग द्वारा पेश किया जा सकता है) निरपेक्ष absorbance के रीडिंग को प्रभावित कर सकते हैं. जैसे थाली औसत या स्तंभ औसत से ऊपर absorbance में अंतर सापेक्ष absorbance रीडिंग, cellulase सकारात्मक क्लोन की पहचान की एक और अधिक मजबूत तरीका है.
पुस्तकालय प्लेटों से सकारात्मक क्लोन की पहचान के बाद, यह करने के लिए माध्यमिक स्क्रीनिंग के लिए एक नई प्लेट में सभी सकारात्मक क्लोनों को दोहराने की सिफारिश की है. यह अच्छी तरह से स्थान या थाली भिन्नता से उत्पन्न होने वाले प्रभाव eliminates और अधिक सकारात्मक क्लोन के बीच प्रत्यक्ष तुलना के लिए अनुमति देता है.
चित्रा 1 उच्च throughput परख के एक metagenomic लायब्रेरी के लिए फ्लो चार्ट ई. में क्लोन कोलाई और -80 पर संग्रहीत डिग्री सेल्सियस
चित्रा 2. Absorbance रीडिंग 384 अच्छी तरह से एक सकारात्मक क्लोन युक्त थाली से. Cellulase सकारात्मक क्लोन नकारात्मक क्लोनों में काफी वृद्धि हुई absorbance के द्वारा पहचाना जा सकता है है.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
एक बड़े डालने के जीनोमिक डीएनए metagenomic पुस्तकालय से cellulolytic गतिविधि के तेजी से पता लगाने के लिए एक उच्च throughput स्क्रीन ई. में व्यक्त कोलाई इस प्रोटोकॉल में वर्णित है. इस विधि / सीएमसी कांगो लाल परख सामान्यतः साहित्य में इस्तेमाल किया पर एक सुधार है. यह आधारित समाधान है, और 384 अच्छी तरह से प्लेटें में एक बर्तन रसायन विज्ञान स्क्रीनिंग के लिए एक थाली मात्रात्मक विश्लेषण के लिए अनुमति पाठक से absorbance रीडिंग के रूप में अंतिम उत्पादन के साथ की अनुमति देता है. प्रति घंटे 25 से अधिक 384 अच्छी तरह से प्लेटों के unsupervised स्क्रीनिंग के लिए इस प्रक्रिया के प्रत्येक चरण के स्वचालन की अनुमति देता है. डेटा आसानी से एक Microsoft Excel स्प्रेडशीट में किया जा सकता है सॉफ्टवेयर से निर्यात, या तीसरे पक्ष के सॉफ़्टवेयर के द्वारा विश्लेषण और प्रसंस्करण के लिए अनुमति देता है.
इस परख की एक सीमा exogenous प्रोटीन ई. में अभिव्यक्ति की क्षमता में मौजूद कोलाई मेजबान. एक metagenomic पुस्तकालय के कई अलग अलग जीवों से डीएनए होते हैं, जिनमें से केवल एक सबसेट ई. द्वारा मान्यता प्राप्त किया जा सकता है है प्रतिलेखन / अनुवाद मशीनरी कोलाई. यहां तक कि जब व्यक्त, exogenous जीन उत्पादों अनुचित तह, प्रसंस्करण, या अपर्याप्त अभिव्यक्ति के स्तर के कारण कार्यशीलता को प्राप्त नहीं हो सकता है. इन सीमाओं प्रतिलिपि नियंत्रण प्रणाली के उपयोग के माध्यम से आंशिक रूप से भरपाई हो सकता है, पिछले कार्यात्मक metagenomic स्क्रीनिंग अध्ययन में देखा के रूप में 12. pCC1 प्रतिलिपि नियंत्रण यहां इस्तेमाल किया fosmid एल arabinose inducer के अलावा के माध्यम से शामिल की अनुमति देता है, और एक से बढ़ जाती है नकल संख्या 13 सेल प्रति 100 प्रतियां के लिए अप करने के लिए. इन पद्धतियों वृद्धि की गतिविधि के लिए बाद में शामिल के साथ स्थिरता के लिए एक प्रति के विकास को सक्षम करने के द्वारा गतिविधि आधारित स्क्रीन के परिणाम में सुधार कर सकते हैं.
सब्सट्रेट 2,4 - DNP - Cellobioside हमारे स्क्रीन में इस्तेमाल किया वाणिज्यिक आपूर्तिकर्ताओं से उपलब्ध नहीं है, लेकिन इसी तरह substrates खरीदा जा सकता है. सिग्मा Aldrich (कैट N4764 नहीं) 2 - nitrophenyl और (कैट N5759 नहीं) 4 nitrophenyl cellobiosides प्रदान करता है. इन substrates के साथ सामान्य स्क्रीन के रूप में वर्णित किया जा सकता है, लेकिन कुछ संशोधनों की आवश्यकता होगी. ये मोनो प्रतिस्थापित phenols अधिक pKa मान है, DNP है, जो लगभग 4 है की तुलना में 7.2 चारों ओर. Cellulase गतिविधि के लिए इष्टतम पीएच 4.5-6.0 14 पीएच, 15 से लेकर सूचित किया गया है. DNP - सी का उपयोग करने के लिए इष्टतम पीएच शर्तों पर किया जा परख के लिए अनुमति देता है, cellulases की आसान पहचान के लिए अनुमति देता है. इसके अलावा, di-प्रतिस्थापित ग्लाइकोसाइड अधिक दूसरों की तुलना में प्रतिक्रियाशील है, और अधिक अनिच्छुक cellulases का पता लगाने के के लिए अनुमति देता है. इस प्रकार, DNP - cellobioside के उपयोग के एक और अधिक मजबूत और संवेदनशील स्क्रीन के लिए अनुमति दी गई है की तुलना में वाणिज्यिक substrates के साथ उपलब्ध होगा.
यह उल्लेखनीय है कि इस स्क्रीन एक संबद्ध वर्णमिति या fluorometric सब्सट्रेट के साथ किसी भी एंजाइमों का पता लगाने के के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. Cellulases एक स्थिर और सक्रिय एंजाइम, प्रारंभिक विकास और स्क्रीनिंग मापदंडों का अनुकूलन के लिए आदर्श हैं. सामान्य दृष्टिकोण यहाँ प्रस्तुत metagenomic पुस्तकालयों की जांच के लिए दोनों शैक्षणिक और औद्योगिक अनुप्रयोगों के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
लेखकों DNP - Cellobioside सब्सट्रेट प्रदान करने के लिए डॉ. स्टीव मुरझाए और हांगकांग मिंग चेन धन्यवाद देना चाहूंगा.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| qPix2 | Genetix | With 384-pin gridding head | |
| qFill3 | Genetix | With 384-well manifold | |
| Varioskan | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ||
| RapidStak | Thermo Fisher Scientific, Inc. | Connected to Varioskan | |
| Micro90 Detergent | Cole-Parmer | 18100-00 | Diluted to 2% in water |
| Ethanol | Major Lab Supplier | Diluted to 80% in water | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | 12.5mg/mL in ethanol |
| LB broth, Miller | Fisher Scientific | BP1426-2 | 25g/L, autoclaved |
| 384-well flat bottom plates | Corning | 3680 | |
| L-(+)-Arabinose | Sigma-Aldrich | A3256 | 100mg/mL in water |
| Potassium Acetate | Fisher Scientific | P171 | 50mM in water, autoclaved, adjusted to pH 5.5 with HCl |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151 | |
| Trizma hydrochloride | Sigma-Aldrich | T3253 | In TE buffer solution, 100mM |
| EDTA disodium salt | Sigma-Aldrich | E5134 | In TE buffer solution, 10mM |
| 2,4-dinitrophenyl cellobioside | Provided by Dr. Steve Withers, UBC | ||
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418 |
References
- Rubin, E. M. Genomics of cellulosic biofuels. Nature. 454, 841-845 (2008).
- Voget, S., Steele, H. L., Streit, W. R. Characterization of a metagenome derived halotolerant cellulase. J. Biotechnol. 126, 26-36 (2006).
- Duan, C. J. Isolation and partial characterization of novel genes encoding acidic cellulases from metagenomes of buffalo rumens. J. Appl. Microbiol. 107, 245-256 (2009).
- Zhang, Y. H. P. Outlook for cellulase improvement: Screening and selection strategies. Biotech. Advances. 24, 452-481 (2006).
- Teather, R. M., Wood, P. J. Use of congo red-polysaccharide interactions in enumeration and characterization of cellulolytic bacteria from the bovine rumen. Appl. And Environ. Microbiol. 43, 777-780 (1982).
- Sharrock, K. R. Cellulase assay methods: a review. J. Biochem and Biophys Methods. 17, 81-106 (1988).
- Kasana, R. C., Salwan, R., Dhar, H., Dutt, S., Gulati, A. A rapid and easy method for detection of microbial cellulases on agar plates using Gram's Iodine. Curr. Microbiology. 57, 503-507 (2008).
- Huang, J. S., Tang, J. Sensitive assay for cellulase and dextranase. Anal. Biochem. 73, 369-377 (1976).
- Tull, D., Withers, S. G. Mechanisms of cellulases and xylanases: A detailed kinetic study of the exo-beta-1,4-glycanase from Cellulomonas fimi. Biochemistry. 33, 6363-6370 (1994).
- Martinez, A., Bradley, A. S., Waldbauer, J. R., Summons, R. E., DeLong, E. F. Proteorhodopsin photosystem gene expression enables photophosphorylation in a heterologous host. PNAS. 104, 5590-5595 (2007).
- Taupp, M., Lee, S., Hawley, A., Yang, J., Hallam, S. J. Large Insert Environmental Genomic Library Production. J Vis Exp. , (2009).
- Martinez, A., Tyson, G. W., DeLong, E. F. Widespread known and novel phosphonate utilization pathways in marine bacteria revealed by functional screening and metagenomic analyses. Environ Microbiol. 12, 222-238 (2010).
- Wild, J., Hradecna, Z., Szybalski, W. Conditionally amplifiable BACs: Switching from single-copy to high-copy vectors and genomic clones. Genome Research. 12, 1434-1444 (2002).
- Johnson, E. A. Sacchirification of complex cellulosic substrates by the cellulase system from Clostridium thermocellum. Appl Environ Microbiology. 43, 1125-1132 (1982).
- Stutzenberger, F. J. Cellulase Production by Thermomonospora curvata isolated from municipal solid waste compost. Appl Environ Microbiol. 22, 147-152 (1971).
