Summary
该协议描述了一种在大肠杆菌中表达了宏基因组文库的纤维素活动的高通量筛选。屏幕解决方案的基础和高度自动化，并采用一锅煮化学与最后一个测吸光度读数在384孔板。
Abstract
纤维素，有机碳在这个星球上最丰富的来源，具有广泛的工业应用日益重视生物燃料生产 1 。修改或降解纤维素的化学方法通常需要强酸和高温。因此，酶的方法已经成为突出的生物转化过程中。虽然已经有点有效识别来自细菌和真菌菌株的积极纤维素酶，微生物在自然界中的绝大多数抵制实验室培养。环境基因组学，又称宏基因组，筛选方法有很大的希望，在弥合在培育新型生物转化酶的搜索差距。宏基因组筛选方法已成功地从环境恢复新颖纤维素酶作为土壤2，水牛瘤胃3和白蚁后肠4使用羧甲基纤维素钠（CMC）的琼脂板用刚果红染料（5 Teather和木材的方法的基础上）染色不同。然而，中央军委的方法是在吞吐量有限，不定量，并表现出低信号信噪比6。其他方法已经7,8报道，但每次使用的琼脂平板为基础的检测，这是为大型插入基因组文库的高通量筛选的不良。在这里，我们提出了一个解决方案，基于纤维素酶的活动，使用显色二硝基苯酚（DNP）cellobioside基板9屏幕。我们的资料库，克隆到fosmid增加检测的灵敏度，通过拷贝数诱导 10 pCC1复制控制。该方法使用一锅煮化学作为测吸光度提供的最终读数384孔板。定量，灵敏，吞吐量高达每天100X 384孔板使用液体处理和附有堆垛系统酶标仪自动读数。
Protocol
本议定书开始之前，您将需要您的宏基因组文库在384孔板格式存储。在我们的研究中，我们结合使用噬菌体T1耐TransforMax EPI300 - T1 ř 大肠杆菌 pCC1复制fosmid矢量控制大肠杆菌细胞库的主机和存储我们的板在-80℃11。
1。复制的宏基因组文库板
- 除霜板包含您的图书馆在37℃，约20分钟，或者直到所有的水井都解冻。
- 消毒15分钟的机器人上qPix2使用的紫外灯灭菌功能。
- 100ug/mL 12.5ug/mL和阿拉伯糖的终浓度在500毫升的试剂瓶，准备与氯霉素LB培养基。每个板块将使用约20ML，再加上作出额外的50毫升，让死体积。
- 设置连接通过媒体瓶无菌管歧管生产商的说明qFill3。适量的媒体计划，并设置它填补了在每孔45uL体积。
- 清除空气中使用清除功能的机器人，直到媒体可见来自歧管的每一个引脚从油管和多方面的。
- 用LB媒体使用qFill3填写所需数量的板块。每盘大约需要20秒，以填补。
- 装入适当的qPix2机器人领域的库板和新鲜的板块。填写相应的试剂清洁浴缸; 2％，在后方浴Micro90，蒸压在中间浴蒸馏水，80％的乙醇在前面浴。
- 使用“复制”计划的qPix2。在软件中，选择适当的头，源盘和目标板的数量和类型。还成立了头之间的复制，通常6个周期，在每次洗澡清洁就足够了。机器容量是在10板，它需要大约15分钟复制一个384针的头（或与一个96针的头部约50分钟）。
注意：有一个选项“爆炒来源”或“爆炒目的地”。建议不使用这些选项的问题与我们的机器人使用他们先前发生。 - 板块一旦被复制，成长在37 ° C，湿度中24小时的板块。因为我们除了与阿拉伯糖诱导的fosmid的高拷贝数，克隆往往增长慢于非诱导克隆。库板返回至-80 ° C
注：在湿度中孵化确保媒体蒸发不会发生在板块的边缘井，所有油井保持一个统一的环境。 - 首先净化水（约50毫升）和80％的乙醇（〜50毫升）的清洁qFill3机器人。拆卸的组件，以及清洁和高压灭菌器在铝箔包裹的瓶子，盖子，和油管。
2。测量E 的生长大肠杆菌克隆
- 从37 ° C培养箱中取出的板块。删除和杂志加载RapidStak提供的平台上预留的盖子，放置板，最多25板。
注：该板块在堆栈的底部将是第一个被读取。请一定要保持轨道板的顺序，软件不记录。 - 快速Stak取出一本杂志，请确保它是空的，并推到栈板块予以。抓住手柄，都应该加载到杂志的板块。装入RapidStak杂志。
注：该杂志表示板块的A1井应该去哪个角落的角落的一个小螺丝钉。杂志将只安装在一个方向的RapidStak。 - 打开的机器连接到计算机上的SkanIt可再生能源计划。选择“新建会话”，并为其适当命名。选择板型“康宁平底384孔板”。
- 在“板布局”区域，选择“向导”按钮，并选择添加到你的盘子384未知数。
- 在“议定书”的区域，选择“好循环”选项，然后输入384口井。一个“好环”图标，将出现在流树屏幕的左侧。选择图标，并单击“添加”光度测量“。将它设置在600nm处读取。
- 节省您的协议，一个独特的名字和关闭SkanIt稀土程序。
- 在计算机上，打开PolaraRS方案。
- 在主页上，会有表，表中列出的RapidStak设备相连的文书。 VarioSkan应在本表的左侧。 VarioSkan标题下，将有两个环节“RunSession”和“孵化”。点击“RunSession”选项。
- 会出现一个新窗口，检测窗口，在中间的流程图。选择“RunSession”的项目（它应该是唯一的项目目前）。在屏幕右侧的下拉菜单会出现。找到您保存SkanIt在此菜单中运行的可再生能源的名称。
注：此菜单似乎有没有合理的订货。它不是按字母顺序排列，或加入日期，或有关协议在计算机上保存。这意味着你必须寻找才找到自己的所有协议，这是一种痛苦。 - 一旦你选择了您的协议，在右上角点击“运行检测”。
- 会弹出一个框，问你，以表示该杂志作为源使用，杂志是空的。在屏幕上下方的方块中，对应于前面的杂志。 [可选：它要求你输入加载板，以确定一个估计的时间，当局将会采取什么。这个估计是通常的方式。]
- 确保RapidStak和VarioSkan打开，按“OK”。
- RapidStak将自动加载到您的板酶标仪，允许连续测量板。要阅读25板，约需50分钟。
注：建议观察VarioSkan到的第一个装版的机器，以确保正确对齐。如果RapidStak不会加载正确的酶标仪，使用“暂停检测”按钮，在右上角的PolaraRS窗口。 - 一旦VarioSkan是阅读完所有的板，取出完整的杂志和杂志上装载平台。抬起平台外的矩形，杂志应该滑落，留下站在一堆在中间板块。更换盖到相应的板块。
3。除了以每块板的含量组合
- 准备检测混合使用预制裂解混合10倍的股票（10％TRITON X - 100，10MM，100MM RIS EDTA的），50mm的醋酸钾缓冲在pH值5.5。准备一个股票75mg/mL的DNP - cellobioside基板在DMSO，确保基材充分溶解。检测混合添加的DNP - cellobioside原液的终浓度为0.1mg/ml。每个板块将使用约溶液20ml，再加上作出额外的50毫升，让死体积。
注：DNP - Cellobioside是不易溶于水，因此溶解在DMSO增加溶解度。 DMSO在最后的检测解决方案，但没有发现有明显的效果。 - 设置连接通过媒体瓶无菌管歧管生产商的说明qFill3。适量的媒体计划，并设置它填补了在每孔45uL体积。
- 清除空气中使用清除功能的机器人，直到媒体可见来自歧管的每一个引脚从油管和多方面的。
- 检测混合添加到每个板使用qFill3。每盘大约需要20秒，以填补。
- 一旦检测混合添加，板块在37 °湿度中C为12-16小时。
注：在培养板一旦检测混合添加将导致蒸发板的外井，收益较高的吸光度读数比内井。这可以抵消孵化湿度室板。
4。读吸光度检测克隆
- 从37 ° C培养箱中取出的板块。删除和杂志加载RapidStak提供的平台上预留的盖子，放置板，最多25板。
注：该板块在堆栈的底部将是第一个被读取。请一定要保持轨道板的顺序，软件不记录。 - 快速Stak取出一本杂志，请确保它是空的，并推到栈板块予以。抓住手柄，都应该加载到杂志的板块。装入RapidStak杂志。
注：该杂志表示板块的A1井应该去哪个角落的角落的一个小螺丝钉。杂志将只安装在一个方向的RapidStak。 - 打开的机器连接到计算机上的SkanIt可再生能源计划。选择“新建会话”，并为其适当命名。选择板型“康宁平底384孔板”。
- 在“板布局”区域，选择“向导”按钮，并选择添加到你的盘子384未知数。
- 在“议定书”的区域，选择“好循环”选项，然后输入384口井。一个“好环”图标，将出现在流树屏幕的左侧。选择图标，并单击“添加”光度测量“。将它设置在400nm的阅读。
- 节省您的协议，一个独特的名字和关闭SkanIt稀土程序。
- 在计算机上，打开PolaraRS方案。
- 在主页上，会有表，表中列出的RapidStak设备相连的文书。 VarioSkan应在本表的左侧。 VarioSkan标题下，将有两个环节“RunSession”和“IncubatE“，点击”RunSession“选项。
- 会出现一个新窗口，检测窗口，在中间的流程图。选择“RunSession”的项目（它应该是唯一的项目目前）。一个下拉菜单就会出现在屏幕右侧。找到您保存SkanIt在此菜单中运行的可再生能源的名称。
- 一旦您选择了您的协议，在右上角点击“运行检测”。
- 会弹出一个框，问你，以表示该杂志作为源使用，杂志是空的。在屏幕上下方的方块中，对应于前面的杂志。 [可选：它要求你输入加载板，以确定一个估计的时间，当局将会采取什么。这个估计是通常的方式。]
- 确保RapidStak和VarioSkan打开，并按下“确定”
- RapidStak将自动加载到您的板酶标仪，允许连续测量板。
注：建议观察VarioSkan到的第一个装版的机器，以确保正确对齐。如果RapidStak不会加载正确的酶标仪，使用“暂停检测”按钮，在右上角的PolaraRS窗口。 - 一旦VarioSkan是阅读完所有的板，取出完整的杂志和杂志上装载平台。抬起平台外的矩形，杂志应该滑落，留下站在一堆在中间板块。该板可根据您的实验室程序处理。
- 要导出的吸光度读数，开放SkanIt RE软件，并选择“打开一个现有的文件”。
- 选择您保存您的会话所在的目录，按下“+”图标展开列表和标题标题下，将标有“容器1”到“集装箱N”的板块数量而定的选项。选择要分析的第一板块。
- 在页面顶部的菜单栏中，选择“数据处理>报告/导出”
- 选择出口所需的选项。
注：我通常选择“板布局”和“出口”光度数据。 - 单击“查看报告”和“文件>保存”。选择所需的目录。输出格式是Microsoft Excel电子表格
5。代表性的成果
从单一的384板包含一个阳性克隆吸光度读数的一个例子是如图2所示。阳性克隆比那些不表达纤维素酶的吸光度明显增加。检测时间的差异，以及板的位置，或DNP浓度（可筛选出未溶解的DNP出台）可以影响绝对吸光度读数。相对吸光度读数，如在上述板块平均或列平均吸光度的差异，是一个更强大的纤维素确定阳性克隆的方法。
库板的阳性克隆鉴定后，建议复制到一个新盘二次筛选阳性克隆。这消除了井的位置或板块的变化所产生的影响，并允许更多的阳性克隆之间的直接比较。
图1：高通量的检测流程图表为宏基因组文库克隆到大肠杆菌大肠杆菌和保存于-80 ° C。
图2。吸光度读数从一个384孔板包含一个阳性克隆。纤维素酶阳性克隆可以显着增加了负面克隆吸光度确定。
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Discussion
在大肠杆菌中表达了一个高通量筛选，从一个大的插入基因组DNA的宏基因组文库的快速检测纤维素活动大肠杆菌是在本议定书。这个方法是在CMC /刚果红在文献中常用的检测改善。这是解决方案为基础，并允许一锅煮化学筛选与定量分析，使读者从板块的吸光度读数最终输出384孔板。在这个过程的每一步自动化允许超过25每小时384板无监督检查。从软件中的数据可以很容易地导出到Microsoft Excel电子表格，或通过第三方软件进行分析处理。
这个实验的一个局限在大肠杆菌表达外源蛋白的潜力存在大肠杆菌主机。一个宏基因组库的一个子集，其中包含来自许多不同生物的DNA，可以确认的大肠杆菌大肠杆菌转录/翻译机器。即使表示，外源基因的产品可能无法实现的功能，由于不当的折叠，加工，或表达水平的不足。这些限制，可以部分抵消通过复制控制系统的利用率，在以前的功能的宏基因组筛查研究 。 12。 pCC1复制控制fosmid用在这里可以通过诱导L -阿拉伯糖诱导此外，从一个增加拷贝数，每个单元13至100份。这些系统可以改善，有利于稳定为增加活动的后续感应的单一副本增长的活动为基础的屏幕的结果。
2,4 - DNP Cellobioside在我们的屏幕上用的基材是没有商业供应商提供，但可以购买类似的基板。 Sigma - Aldrich公司提供2 - 硝基苯（猫号N4764）和4 - 硝基苯（猫号N5759）cellobiosides。一般屏幕所描述的那样，可以进行与这些基板，但将需要一些修改。这些单取代的酚类物质有较高的pKa值在7.2左右，相比，DNP，约4。据报道，纤维素酶的最适pH值范围从14，15 pH值4.5-6.0 。 DNP - C的使用允许在最适pH条件下进行的检测，从而更容易识别的纤维素。此外，DI -取代苷是远远超过其他人的反应，从而更不愿意纤维素酶的检测。因此，使用DNP - cellobioside允许一个更强大和敏感的屏幕，将与商业基板。
值得注意的是，这个屏幕可以与任何一个关联的比色或荧光底物酶的检测。纤维素酶是一个稳定和活性酶，最初的开发和筛选参数优化的理想。这里介绍的一般方法是一个强大的工具为学术和工业应用的宏基因组库的筛选。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
作者要感谢史蒂夫威瑟斯博士和香港明陈提供的DNP - Cellobioside基板。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| qPix2 | Genetix | With 384-pin gridding head | |
| qFill3 | Genetix | With 384-well manifold | |
| Varioskan | Thermo Fisher Scientific, Inc. | ||
| RapidStak | Thermo Fisher Scientific, Inc. | Connected to Varioskan | |
| Micro90 Detergent | Cole-Parmer | 18100-00 | Diluted to 2% in water |
| Ethanol | Major Lab Supplier | Diluted to 80% in water | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | 12.5mg/mL in ethanol |
| LB broth, Miller | Fisher Scientific | BP1426-2 | 25g/L, autoclaved |
| 384-well flat bottom plates | Corning | 3680 | |
| L-(+)-Arabinose | Sigma-Aldrich | A3256 | 100mg/mL in water |
| Potassium Acetate | Fisher Scientific | P171 | 50mM in water, autoclaved, adjusted to pH 5.5 with HCl |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151 | |
| Trizma hydrochloride | Sigma-Aldrich | T3253 | In TE buffer solution, 100mM |
| EDTA disodium salt | Sigma-Aldrich | E5134 | In TE buffer solution, 10mM |
| 2,4-dinitrophenyl cellobioside | Provided by Dr. Steve Withers, UBC | ||
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418 |
References
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