Summary
הפגנה של כימות dsDNA באמצעות מולקולרית בדיקות PicoGreen לצבוע Hitachi ו-F-7000 ספקטרופוטומטר Fluorescence מצויד אביזר microplate הקורא.
Abstract
כימות של ה-DNA, בעיקר בריכוזים קטנים, היא משימה חשובה עם מגוון רחב של יישומים ביולוגיים כולל תקן מבחני ביולוגיה מולקולרית כגון סינתזה וטיהור של ה-DNA, אבחון יישומים כגון כימות של מוצרי הגברה DNA, גילוי של מולקולות דנ"א סמים ההכנות. במהלך וידיאו זה נדגים את היכולת של ספקטרופוטומטר Hitachi F-7000 Fluorescence מצויד אביזר Micro Reader פלייט לבצע כימות dsDNA באמצעות בדיקות מולקולריות קוואנט, זה PicoGreen ערכת צבע מגיב.
ספקטרופוטומטר F-7000 Fluorescence מציעה רגישות גבוהה מדידות מהירות גבוהה. זוהי מערכת גמישה המסוגלת מדידת הקרינה, הארה, זרחני. מספר מצבי מדידה זמינים, כולל גל סריקה, סריקה בזמן, photometry ו 3-D מדידה סריקה. ספקטרופוטומטר יש רגישות בטווח של 50 picomoles של והעמסת בעת שימוש בנפח 300 מדגם μL ב microplate, והוא מסוגל למדוד מהירות סריקה של 60,000 ננומטר / דקה. כמו כן, יש טווח דינמי רחב של עד 5 סדרי גודל המאפשר שימוש של עקומות כיול על פני טווח רחב של ריכוזים. מערכת אופטית משתמשת בכל אופטיקה רעיוני לאנרגיה רגישות מקסימלית. טווח אורך הגל הסטנדרטי הוא 200-750 ננומטר, ניתן להרחיב 900 ננומטר, כאשר באחת photomultipliers אופציונלי אינפרא אדום הקרוב. המערכת מאפשרת בקרת טמפרטורה אופציונלי עבור הקורא צלחת 5-60 מעלות צלזיוס בטמפרטורה באמצעות אופציונלי חיצוני מבוקר circulator נוזלי. הקורא microplate מאפשר שימוש של 96 microplates היטב, את מהירות המדידה עבור 96 בארות הוא פחות מ 60 שניות בעת שימוש במצב קינטיקה.
שולטת תוכנה עבור ה-F-7000 ו microplate Reader הם גם גמישה. דוגמאות ניתן להגדיר פורמטים או עמודה או שורה, וכן כל שילוב של בארות עשוי להיבחר מדידות מדגם. זה מאפשר ניצול אופטימלי של microplate. בנוסף, התוכנה מאפשרת ייבוא מיקרו מדגם צלחת תצורות שנוצרו ב-Excel שנשמרו ערכים מופרדים בפסיקים, או "csv" פורמט. תצורות microplate מדידה ניתן לשמור נזכר על ידי התוכנה לנוחות ויעילות מוגברת. תוצאות הנתונים יכול להיות פלט דיווח סטנדרטי, ל-Excel, או תוכנית דווח אופציונלי גנרטור.
Protocol
1. כלי ההתקנה
- הפעל spectrofluorometer ולאפשר להתחמם במשך שעה 1.
- שימוש ב-Excel ליצור קובץ עם תקנים נתונים לדוגמה, כפי שמוצג באיור 1 ולשמור אותו סי.אס. "csv" פורמט.
באיור 1. לתקנים נתוני דגימות. - הגדרת fluorometer כדלקמן:
- לחץ על
כפתור זה ייפתח חלון שיטת ניתוח, באיור 2. 
איור 2. שיטת ניתוח חלון, הכרטיסייה כללי.
בצע את הבחירות הבאות:- בשדה "מדידה", בחר photometry מ למשוך למטה בתפריט.
- בשדה "מפעיל", להזין את שם המפעיל המתאים.
- אין צורך להזין מידע בשדה "כלי". זו נבחרת באופן אוטומטי על ידי התוכנה.
- השדה "דגימה" אינו פעיל בעת שימוש בקורא microplate.
- הזן הערות אשר ייתכן שתרצה לכלול בדוח בשדה "הערות".
- בשדה "אביזרים", להזין מידע הקשור האביזרים המשמשים לבדיקה זו.
- הערה הכפתורים בצד ימין של החלון.
- כפתור "טען" מאפשר טעינה שיטות ניתוח שנשמרו בעבר.
- "שמור" כפתור המאפשר עדכון סדרה של פרמטרים מבחן או שיטת ניתוח הציל בעבר נטען, תוך שימוש באותו שם.
- "שמור בשם" כפתור מאפשר חיסכון קבוצה חדשה של פרמטרים מבחן או שיטת ניתוח בשם הרצוי.
איור 3. שיטת ניתוח חלון, לשונית quantitation.- בשדה "סוג quantitation", בחר אורך גל. זה מצביע על קריאה הקרינה ייעשה באמצעות הגל הנבחר.
- בשדה "סוג כיול", בחר 1 כדי st.
- בשדה "מספר אורכי גל", בחר 1.
- בשדה "יחידת ריכוז", הזן ng / mL.
- השאירו את תיבות נבחר עבור "כיול ידני" ו "עקומת כוח דרך אפס".
- ב "ספרות אחרי הנקודה העשרונית" שדה, בחר 2.
- ב "הגבלהתחתונה ריכוז" שדה, הזן 0.
- בשדה "ריכוז גבול עליון, הזן 10000.
כעת לחץ על הלשונית "כלי" ולעשות את הבחירות הבאות.
איור 4. שיטת ניתוח חלון, בכרטיסיה כלי- ב "מצב נתונים:" את השדה, בחר פלואורסצנטי.
- "מהירות קיצוץ" השדה אינו פעיל בשלב זה, הוא משמש רק עבור מדידות זרחני.
- בשדה מצב "אורך גל", בחר גם קבוע WL.
- בשדה "EX / WL1" להיכנס 480nm.
- ב "EM / WL1" שדה להיכנס 520nm.
- כל השדות האחרים תחת EX ו EM אינם פעילים בשלב זה.
- בשדה "EX סדק" לבחור 5.0nm מ למשוך למטה בתפריט.
- בשדה "א.מ. סדק" לבחור 5.0nm מ למשוך למטה בתפריט.
- השאירו נבחר בתיבת מול "מתח PMT 1-1000V" את השדה.
- בשדה "PMT מתח", בחר 700V מ למשוך למטה בתפריט.
- ב "calc סטטיסטי אוטומטי. מספר" בשדה לבחור 2.
- בשדה "משכפל" לבחור 1.
- בשדה "זמן אינטגרציה", בחר 0.1s. </ Li>
- בשדה "עיכוב" הזן או בחר 0s.
איור 5. שיטת ניתוח חלון, הכרטיסיה צג.- ב "ציר Y", "מקס:" שדה, בחר 10000
- ב "ציר Y", "מינימום:" שדה, בחר 0.
- בחר בתיבה משמאל את "פתח עיבוד נתונים לאחר רכישת נתונים".
- השאירו נבחר את תיבת משמאל "הדו"ח הדפסת לאחר רכישת נתונים", אלא אם כן אתה רוצה לדווח תודפס באופן אוטומטי לאחר קריאות הושלמו.
איור 6. שיטת ניתוח חלון, Tab דוח.- בשדה "פלט", בחר דוח הדפסה מתוך למשוך למטה בתפריט. אתה יכול גם לבחור "השתמש ב-Microsoft Excel" אם אתה רוצה לייצא את הנתונים ל-Excel, או "הדפסה השתמש מחולל גיליון" אם באמצעות להוסיף אופציונלית על מחולל דוחות תוכנית אשר תאפשר הפקת דוחות בהתאמה אישית.
- לחץ על תיבות עבור הפריטים שברצונך לכלול בדוח.
- כדי לשמור את כל הפרמטרים שנבחרו בכרטיסיות שונות של החלון "שיטת ניתוח", לחץ שוב על הכרטיסייה "כללי" ולשמור אותם תחת שם הקובץ במיקום שבו אתה יכול למצוא אותם לשימוש עתידי, ולחץ על " אישור "כדי לסגור את החלון.
- זה משלים את הגדרת פרמטרים של מכשיר הבדיקה.
- כעת נוכל להגדיר את הקורא microplate.
- לחץ על
כפתור, אשר יביא את חלון ההתקנה MPR על העליונה.
איור 7. MPR חלון ההתקנה, הכרטיסייה פלייט.- לחץ על המיקום A1 ו לגרור את העכבר כדי E1, ואז ללחוץ על
כפתור. זה יבחר את העמדות לשמש הסטנדרטים. עמדות אלו יודגשו בצבע ירוק. - עכשיו אנחנו צריכים לבחור F1 עמדות H3 עבור הדגימות. לחץ וגרור את העכבר החל F1 עמדה, לעמדה H3 ולאחר מכן לחץ על
כפתור, זה ידגיש את עמדות בצבע צהוב. - ואז לחזור על הפעולה זהה עבור עמדות A2 ל-E3, כדי לבחור אותן עמדות למדידות המדגם.
- עכשיו, בואו לטעון את הקובץ מופרדים בפסיקים הקובץ משתנה (CSV) שהוכן מראש עם לתקנים מידע לדוגמא.
איור 8. MPR חלון ההתקנה, הכרטיסיה פרטי טוב.- לאחר מכן לחץ על
כפתור. חלון Windows Explorer יפתח אשר כפי שמוצג באיור 9, אשר יאפשר איתור "ובכן information.csv" קובץ וטעינה בו. 
איור 9. טעינת מידע מדגם היטב.
לאחר טעינת הקובץ "ובכן מידע", "מידע טוב" ייראה כפי שמוצג באיור 10
איור 10. מידע טעון מדגם היטב.
- לחץ על
כפתור זה ייפתח חלון שיטת ניתוח, באיור 2. 
כפתור, אשר יביא את חלון ההתקנה MPR על העליונה. 
כפתור. זה יבחר את העמדות לשמש הסטנדרטים. עמדות אלו יודגשו בצבע ירוק. 
כפתור, זה ידגיש את עמדות בצבע צהוב. 
כפתור. חלון Windows Explorer יפתח אשר כפי שמוצג באיור 9, אשר יאפשר איתור "ובכן information.csv" קובץ וטעינה בו. 
2. לדוגמה Picogreen Assay הכנה
- הכן 1X TE חוצץ (10 mM טריס-HCl, 1 mM EDTA) על ידי הוספת 1 מ"ל של 20 X TE הצפתעד 19 מ"ל di H 2 O.
- הכן פתרון PicoGreen מגיב על ידי הוספת 50 μL 200 X מגיב PicoGreen עד 9.95 הצפת מ"ל 1 X TE.
- הכנת תקנים (Lambda dsDNA) על ידי ביצוע דילולים הסידורי של המניות dsDNA (100 מיקרוגרם / מ"ל). ראשית להכין תמיסה של 50 מיקרוגרם / מ"ל dsDNA ידי הוספת 25 μL של המניה dsDNA (100 מיקרוגרם / מ"ל) ו -25 הצפת μL 1 x TE. ואז להכין את פתרונות סטנדרטיים על ידי הוספת כמויות המצוין של dsDNA ו חיץ כמפורט בטבלה שלהלן:
ריכוז dsDNA נפח dsDNA נפח של הצפת 1 מיקרוגרם / מ"ל 20 μL של 50 מיקרוגרם / מ"ל dsDNA 980 μL 1 X TE הצפת 0.1 מיקרוגרם / מ"ל 100 μL של 1 מיקרוגרם / מ"ל dsDNA 900 μL 1 X TE הצפת 0.01 מיקרוגרם / מ"ל 100 μL של 0.1 מיקרוגרם / מ"ל dsDNA 900 μL 1 X TE הצפת 0.001 מיקרוגרם / מ"ל 100 μL של 0.01 מיקרוגרם / מ"ל dsDNA 900 μL 1 X TE הצפת
3. מדידה לתקנים Fluorescence לדוגמא
- פיפטה 150 μL של תקן זה לתוך בארות A1-E1 של צלחת 96 היטב, לכל איור 7, ועל פי הטבלה הבאה:
טוב תקן A1 1 מיקרוגרם / מ"ל B1 0.1 מיקרוגרם / מ"ל C1 0.01 מיקרוגרם / מ"ל D1 0.001 מיקרוגרם / מ"ל E1 1 X TE הצפת - פיפטה 150 דגימות ידוע μL לתוך בארות F1 כדי H3, שמוצג באיור 7
- יוצקים פתרון PicoGreen מוכן בשלב 1.2 לתוך שוקת מיועד לשימוש רב ערוצי פיפטה. השתמש פיפטה רב ערוצי לספק 150 μL פתרון PicoGreen לבארות A1-H3. מערבבים פתרון תקני בעדינות עם פיפטה.
- מניחים צלחת באזור חשוך להמתין 2-5 דקות תגובה לפתח.
4. נציג תוצאות
עקומת כיול טוב מוערך באמצעות פרמטרים שונים הניתנים על ידי תוכנת ה-F-7000 על מדידה של סטנדרטים החישוב של עקומת הכיול על ידי התוכנה.
מקדם נחישות מציין את מטיב ההתאמה של הסטנדרטים נמדד עקומת כיול מחושב. ככל ערך זה היא "1", טוב יותר את ההתאמה של הערך הנמדד ואת עקומת כיול.
אם הערך הוא רחוק מלהיות "1", סטנדרטים חייבים להיות נמדד מחדש, מוכן שוב, או הכושר של עקומת הכיול השתנה.
איור 11 מציג דוגמה של עקומת כיול עם מקדם נחישות מחושב = 0.99993, השיג עבור כימות dsDNA PicoGreen באמצעות צבע.
איור 11. דוגמה של עקומת כיול dsDNA.
Discussion
Pipetting זהירות במהלך הכנת המדגם, וכן באמצעות ספקטרופוטומטר הקרינה יציבה רגיש חיונית להשגת תוצאות טובות לשחזור.
במקרה של ספקטרופוטומטר את הקרינה משמשים מבחן זה, הוא הציע להשתמש מדגם 300 μL נפח הסופי הקורא microplate. נפח נמוך מקטין את רגישות, נפח גדול יותר עלול לגרום לזיהום הכלאה בין בארות.
Disclosures
לואיס מורנו א ו ל קנדרה קוקס מועסקים על ידי Hitachi גבוהה טכנולוגיות אמריקה המייצרת את המכשיר משמש במאמר זה.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Distilled H2O | Reagent | |||
| Quant-iT Picogreen dsDNA Assay Kit from Invitrogen | Reagent | P7589 | ||
| Nalge Nunc Fluorescence Microplates p/n 237108 | Supply | 237108 | ||
| 12 Channel Eppendorf Micropipette | Supply | 3516677 | ||
| 1000 μL Eppendorf Pipette | Supply | |||
| 200 μL Eppendorf Pipette | Supply | |||
| 10 mL serological pipet | Supply | |||
| Aluminum foil | Supply | |||
| Pipette tips | Supply | |||
| Hitachi F-7000 Fluorescence Spectrophotometer with FL Solutions 2.1 | Equipment | 5J1-0003 | ||
| Microplate Reader Accessory for F-7000 | Equipment | 5J0-0139 |
References
- Singer, V. L., Jones, L. J., Yue, S. T., Haugland, R. P. Characterization of PicoGreen reagent and development of a fluorescence-based solution assay for double-stranded DNA quantitation. Analytical Biochemistry. 249 (2), 228-238 (1997).
