Summary
DsDNA आण्विक जांच PicoGreen डाई और Hitachi एफ-7000 प्रतिदीप्ति एक microplate रीडर गौण के साथ सुसज्जित स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग की मात्रा का ठहराव के प्रदर्शन.
Protocol
1. साधन सेटअप
- Spectrofluorometer पर मुड़ें और 1 घंटे के लिए गर्म करने की अनुमति.
- का उपयोग करना Excel मानक और नमूना डेटा के साथ एक फ़ाइल बनाने के लिए, जैसा कि चित्र 1 में दिखाया गया है और यह अल्पविराम द्वारा अलग में सहेजें ". Csv" प्रारूप मूल्यों.
चित्रा 1. मानक और नमूने डेटा. - Fluorometer के रूप में सेट करें:
- पर क्लिक करें
बटन, इस विश्लेषण विधि विंडो, 2 अंजीर में दिखाया गया है खुल जाएगा. 
चित्रा 2. विश्लेषण विधि, खिड़की सामान्य टैब.
निम्न चयन करें:- "मापन" क्षेत्र में, पुल डाउन मेनू से भामिति का चयन करें.
- "संचालक" क्षेत्र में, उपयुक्त ऑपरेटर का नाम दर्ज करें.
- "साधन" फ़ील्ड में जानकारी दर्ज करने की आवश्यकता नहीं है. इस सॉफ्टवेयर के द्वारा स्वचालित रूप से चयनित है.
- "नमूनाकरण" फ़ील्ड निष्क्रिय है जब microplate रीडर का उपयोग.
- कोई टिप्पणी दर्ज करें जो आप "कमेन्ट" क्षेत्र में रिपोर्ट में शामिल करना चाहते हो सकता है.
- "गौण" क्षेत्र में, इस परीक्षण के लिए इस्तेमाल सामान से संबंधित जानकारी दर्ज करें.
- विंडो के दाईं ओर के बटन पर ध्यान दें.
- "लोड" बटन पहले से बचाया विश्लेषण तरीके लोड हो रहा है की अनुमति देता है.
- "सहेजें" बटन परीक्षण पैरामीटर या विश्लेषण पहले बचाया और लोड विधि का एक सेट को अद्यतन करने, एक ही नाम का उपयोग करने की अनुमति देता है.
- बटन एक वांछित नाम के तहत एक परीक्षण पैरामीटर या विश्लेषण विधि का एक नया सेट को बचाने की अनुमति देता है "के रूप में सहेजें".
चित्रा 3. विश्लेषण विधि, खिड़की quantitation टैब.- "Quantitation प्रकार क्षेत्र में, वेवलेंथ का चयन करें. यह इंगित करता है प्रतिदीप्ति पढ़ने चयनित तरंग दैर्ध्य का उपयोग किया जाएगा.
- "अंशांकन प्रकार क्षेत्र में, 1 सेंट आदेश का चयन करें.
- "तरंगदैर्य की संख्या" क्षेत्र में, 1 का चयन करें.
- "एकाग्रता इकाई" फ़ील्ड में, एनजी / एमएल दर्ज करें.
- अचयनित बक्से "मैनुअल अंशांकन" और "शून्य के माध्यम से सेना वक्र" के लिए छोड़ दें.
- क्षेत्र "दशमलव बिंदु के बाद अंकों" में, 2 का चयन करें.
- "लोअर एकाग्रता सीमा" फ़ील्ड में, 0 दर्ज करें.
- "ऊपरी एकाग्रता सीमा क्षेत्र में, 10000 दर्ज करें.
अब "साधन" टैब पर क्लिक करें और निम्न चयन करें .
चित्रा 4. विश्लेषण विधि विंडो, साधन टैब- "डेटा मोड:" फ़ील्ड में, प्रतिदीप्ति का चयन करें.
- "काट गति" क्षेत्र निष्क्रिय है इस समय में, यह केवल phosphorescence मापन के लिए प्रयोग किया जाता है.
- "वेवलेंथ मोड" क्षेत्र में, दोनों WL निश्चित चयन करें.
- "पूर्व WL1 /" फ़ील्ड में 480nm दर्ज करें.
- "EM / WL1" क्षेत्र में 520nm दर्ज करें.
- पूर्व के अंतर्गत सभी अन्य क्षेत्रों EM और इस समय में निष्क्रिय कर रहे हैं.
- पुल डाउन मेनू से "EX भट्ठा क्षेत्र में 5.0nm का चयन करें.
- पुल डाउन मेनू से "भट्ठा EM" फ़ील्ड में 5.0nm का चयन करें.
- "PMT वोल्ट 1-1000V" क्षेत्र के सामने बॉक्स को अचयनित छोड़ो.
- "PMT वोल्ट" क्षेत्र में, पुल डाउन मेनू से 700V चयन करें.
- "ऑटो आंकड़ा calc संख्या." फ़ील्ड में 2 का चयन करें.
- "Replicates" क्षेत्र में 1 का चयन करें.
- "एकता" समय क्षेत्र में 0.1s का चयन करें <./ Li>
- "देरी" फ़ील्ड में दर्ज करें या 0s का चयन करें.
चित्रा 5. विश्लेषण विधि विंडो, मॉनिटर टैब.- "Y अक्ष", "अधिकतम" क्षेत्र, 10000 का चयन करें
- Y अक्ष "," न्यूनतम: "क्षेत्र, 0 का चयन करें.
- "डाटा अधिग्रहण के बाद ओपन डाटा प्रोसेसिंग" के बाईं ओर बॉक्स का चयन करें.
- "डाटा अधिग्रहण के बाद प्रिंट रिपोर्ट" की बाईं करने के लिए बॉक्स चुना गया, तो जब तक आप एक के लिए स्वचालित रूप से मुद्रित किया जा के बाद रीडिंग पूरा कर रहे हैं रिपोर्ट करना चाहते छोड़ो.
चित्रा 6. विश्लेषण विधि विंडो में, रिपोर्ट टैब .- "आउटपुट" फ़ील्ड में, पुल डाउन मेनू से प्रिंट रिपोर्ट का चयन करें. आप यह भी चयन "Microsoft Excel का उपयोग करें यदि आप Excel में निर्यात डेटा, या" का प्रयोग करें प्रिंट जेनरेटर शीट "चाहते हैं, अगर प्रोग्राम रिपोर्ट जनरेटर पर वैकल्पिक जोड़ने के जो कस्टम बनाया रिपोर्ट की अनुमति देगा का उपयोग कर सकता है.
- आइटम आप रिपोर्ट में शामिल होना चाहता हूँ के लिए बक्से पर क्लिक करें.
- "विश्लेषण विधि" खिड़की के अलग टैब में सभी चयनित पैरामीटर को बचाने के लिए, फिर से "सामान्य" टैब पर क्लिक करें और उन्हें एक फ़ाइल नाम के तहत और एक स्थान है जहाँ आप उन्हें भविष्य में उपयोग के लिए मिल सकता है में बचाने के लिए, और क्लिक करें " इस विंडो को बंद करने के लिए बटन ठीक है ".
- यह साधन परीक्षण पैरामीटर सेटिंग पूरा करता है.
- अब हम microplate रीडर स्थापित हो जाएगा.
- पर क्लिक करें
बटन, जो शीर्ष पर MPR सेटअप खिड़की लाएगा.
7 चित्रा. MPR सेटअप खिड़की, प्लेट टैब.- A1 स्थिति पर क्लिक करें और E1 के लिए माउस खींचें, तो पर क्लिक करें
बटन. यह मानकों के लिए इस्तेमाल किया जा पदों का चयन करेंगे. उन पदों पर हरे रंग में प्रकाश डाला जाएगा. - अब हम नमूने लिए H3 पदों F1 का चयन करने की आवश्यकता है. क्लिक करें और माउस खींचें स्थिति F1 में शुरू, H3 स्थिति और फिर पर क्लिक करें
बटन, यह पीले रंग में उन पदों पर प्रकाश डाला जाएगा. - फिर E3 के लिए A2 पदों के लिए एक ही आपरेशन को दोहराने के लिए नमूना मापन के लिए उन पदों का चयन करें.
- अब, चलो लोड फ़ाइल कॉमा सेपरेटेड चर फ़ाइल (. Csv) मानक और नमूना जानकारी के साथ अग्रिम में तैयार.
8 चित्रा. MPR सेटअप खिड़की, खैर जानकारी टैब.- फिर क्लिक करें
बटन. एक Windows Explorer विंडो खुलेगा जो के रूप में 9 चित्रा, जो "ठीक है information.csv" फ़ाइल का पता लगाने और इसे लोड हो रहा है की अनुमति देगा में दिखाया. 
9 चित्रा. लोड हो रहा है अच्छी तरह से नमूना जानकारी.
"खैर जानकारी" फ़ाइल लोड करने के बाद, "ठीक जानकारी" के रूप में दिखाया गया चित्रा 10 में दिखेगा
10 चित्रा. नमूना अच्छी तरह जानकारी भरा हुआ है.
- पर क्लिक करें
बटन, इस विश्लेषण विधि विंडो, 2 अंजीर में दिखाया गया है खुल जाएगा. 
बटन, जो शीर्ष पर MPR सेटअप खिड़की लाएगा. 
बटन. यह मानकों के लिए इस्तेमाल किया जा पदों का चयन करेंगे. उन पदों पर हरे रंग में प्रकाश डाला जाएगा. 
बटन, यह पीले रंग में उन पदों पर प्रकाश डाला जाएगा. 
बटन. एक Windows Explorer विंडो खुलेगा जो के रूप में 9 चित्रा, जो "ठीक है information.csv" फ़ाइल का पता लगाने और इसे लोड हो रहा है की अनुमति देगा में दिखाया. 
2. Picogreen परख नमूना तैयार
- 20 एक्स ते बफर के 1 एमएल जोड़कर 1X ते बफर (10 मिमी Tris एचसीएल, 1 मिमी EDTA) तैयार19 एमएल डि एच 2 ओ
- PicoGreen अभिकर्मक समाधान 9.95 एमएल 1 एक्स ते बफर के लिए 50 μL 200 एक्स PicoGreen अभिकर्मक जोड़कर तैयार करें.
- शेयर dsDNA (100 μg / एमएल) के धारावाहिक dilutions बनाकर मानकों (Lambda dsDNA) तैयार करें. पहले शेयर dsDNA (100 μg / एमएल) और 25 μL 1 एक्स ते बफर के 25 μL जोड़कर 50 μg / एमएल dsDNA का एक समाधान तैयार करते हैं. फिर dsDNA के संकेत मात्रा और बफर के रूप में नीचे तालिका में सूचीबद्ध जोड़कर मानक समाधान तैयार:
DsDNA की एकाग्रता DsDNA की मात्रा बफर की मात्रा 1 μg / एमएल 50 μg / एमएल dsDNA के 20 μL 980 μL 1 एक्स ते बफर 0.1 μg / एमएल 1 μg / एमएल dsDNA के 100 μL 900 μL 1 एक्स ते बफर 0.01 μg / एमएल 0.1 μg / एमएल dsDNA के 100 μL 900 μL 1 एक्स ते बफर 0.001 μg / एमएल 0.01 μg / एमएल dsDNA के 100 μL 900 μL 1 एक्स ते बफर
3. मानक के मापन और नमूना प्रतिदीप्ति
- A1-E1 कुओं में 150 प्रत्येक मानक के एक 96 अच्छी तरह से थाली के μL 7 चित्रा प्रति और निम्न तालिका के अनुसार पिपेट:
अच्छी तरह से मानक A1: 1 μg / एमएल बी 1 0.1 μg / एमएल C1 0.01 μg / एमएल D1 0.001 μg / एमएल E1 1 एक्स ते बफर - पिपेट 150 H3, 7 चित्रा में दिखाया गया है μL अज्ञात कुओं F1 में नमूने
- PicoGreen एक मल्टी चैनल के विंदुक उपयोग के लिए डिजाइन गर्त में 1.2 चरण में तैयार समाधान डालो. 150 μL PicoGreen A1-H3 कुओं को हल देने के लिए एक मल्टी चैनल पिपेट का उपयोग करने के लिए. मिक्स समाधान और मानकों धीरे विंदुक के साथ.
- अंधेरे क्षेत्र में प्लेस थाली और प्रतिक्रिया करने के लिए विकसित करने के लिए 2-5 मिनट प्रतीक्षा.
4. प्रतिनिधि परिणाम
एक अच्छा अंशांकन की अवस्था अलग F-7000 सॉफ्टवेयर के द्वारा अंशांकन वक्र के मानकों और गणना की माप पर सॉफ्टवेयर द्वारा प्रदान की पैरामीटर का उपयोग करने के लिए मूल्यांकन किया जाता है.
दृढ़ संकल्प गुणांक मापा मानकों के फिट की भलाई और गणना अंशांकन वक्र इंगित करता है. यह मान "1" के लिए करीब है, मापा मूल्य और अंशांकन वक्र के बेहतर फिट.
यदि मान "1" से दूर है, मानकों फिर से मापा चाहिए, फिर तैयार, या अंशांकन वक्र के फिटनेस परिवर्तित.
चित्रा 11 परिकलित = दृढ़ संकल्प 0.९९,९९३ गुणांक, dsDNA PicoGreen डाई का उपयोग की मात्रा का ठहराव के लिए प्राप्त के साथ एक अंशांकन वक्र के एक उदाहरण से पता चलता है.
11 चित्रा. DsDNA अंशांकन वक्र के उदाहरण.
Discussion
नमूना तैयार करने के दौरान सावधानी pipetting, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से एक स्थिर और संवेदनशील प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग अच्छे और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम प्राप्त करने के लिए आवश्यक है.
प्रतिदीप्ति इस परीक्षण के लिए इस्तेमाल किया स्पेक्ट्रोफोटोमीटर के मामले में, यह 300 μL microplate रीडर में अंतिम नमूना मात्रा का उपयोग करने के लिए सुझाव दिया है. कम मात्रा में संवेदनशीलता कम हो जाती है, और एक बड़ी मात्रा में कुओं के बीच पार संदूषण के कारण हो सकता है.
Disclosures
लुइस ए मोरेनो और केन्द्र एल कॉक्स उच्च Hitachi टेक्नोलॉजीज अमेरिका है कि इस लेख में इस्तेमाल साधन का उत्पादन द्वारा नियोजित कर रहे हैं.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Distilled H2O | Reagent | |||
| Quant-iT Picogreen dsDNA Assay Kit from Invitrogen | Reagent | P7589 | ||
| Nalge Nunc Fluorescence Microplates p/n 237108 | Supply | 237108 | ||
| 12 Channel Eppendorf Micropipette | Supply | 3516677 | ||
| 1000 μL Eppendorf Pipette | Supply | |||
| 200 μL Eppendorf Pipette | Supply | |||
| 10 mL serological pipet | Supply | |||
| Aluminum foil | Supply | |||
| Pipette tips | Supply | |||
| Hitachi F-7000 Fluorescence Spectrophotometer with FL Solutions 2.1 | Equipment | 5J1-0003 | ||
| Microplate Reader Accessory for F-7000 | Equipment | 5J0-0139 |
References
- Singer, V. L., Jones, L. J., Yue, S. T., Haugland, R. P. Characterization of PicoGreen reagent and development of a fluorescence-based solution assay for double-stranded DNA quantitation. Analytical Biochemistry. 249 (2), 228-238 (1997).
