Summary
Demonstration av kvantifiering av dsDNA använda molekylära sonder PicoGreen färgämne och Hitachi F-7000 Fluorescens Spektrofotometer utrustad med en mikroplattor läsare tillbehör.
Abstract
Kvantifiering av DNA, särskilt i små koncentrationer, är en viktig uppgift med en mängd biologiska, inklusive vanliga molekylärbiologiska analyser som syntes och rening av DNA, diagnostiska applikationer såsom kvantifiering av produkter DNA-amplifiering och detektion av DNA-molekyler i läkemedel förberedelser. Under den här videon kommer vi att kunna visa att av Hitachi F-7000 Fluorescens Spektrofotometer utrustad med en Micro plattläsare tillbehör för att utföra dsDNA kvantifiering med hjälp av molekylära sonder Quant-det PicoGreen färgämne reagenskit.
F-7000 Fluorescens Spektrofotometer erbjuder hög känslighet och hög hastighetsmätningar. Det är ett mycket flexibelt system som kan mäta fluorescens, luminiscens och fosforescens. Flera mäta lägen är tillgängliga, inklusive Våglängdsscanning, tid skanna, fotometri och 3-D skanning mätning. Spektrofotometern har känsligheten i intervallet 50 picomoles av fluorescein när man använder en 300 mikroliter provvolym i mikroplattor, och kan mäta skanningshastigheter på 60.000 nm / minut. Den har också ett brett dynamiskt omfång på upp till 5 storleksordningar som möjliggör användning av kalibreringskurvorna över ett brett spektrum av koncentrationer. Det optiska systemet använder alla reflekterande optik för maximal energi och känslighet. Standarden våglängdsområde är 200 till 750 Nm, och kan utökas till 900 nm när man använder en av de frivilliga nära infraröd fotomultiplikatorer. Systemet gör frivilligt temperaturkontroll för plattläsaren 5 till 60 grader med hjälp av en extern temperaturkontroll flytande cirkulationspump. Mikroplattan läsaren tillåter användning av 96 brunnar mikroplattor och mäta hastigheten för 96 brunnar är mindre än 60 sekunder när du använder kinetik läget.
Programvara kontrollerna för F-7000 och mikroplattor Reader är också mycket flexibla. Prov kan ställas in på antingen kolumn eller rad format, och alla kombinationer av brunnar kan väljas för prov mätningar. Detta möjliggör för ett optimalt utnyttjande av mikroplattan. Dessutom ger programmet importerar mikro konfigurationer tallrik prov skapats i Excel och sparas i kommaseparerade värden, eller "CSV"-format. Mikroplattor mäta konfigurationer kan sparas och återkallas av programvaran för bekvämlighet och ökad produktivitet. Data resultat kan matas ut till en vanlig rapport till Excel eller till en extra Report Generator Program.
Protocol
1. Instrument Setup
- Slå på spectrofluorometer och låt värma upp i 1 timme.
- Använda Excel skapa en fil med de normer och exempeldata som visas i figur 1 och spara den i separerade komma värden "CSV"-format.
Figur 1. Standarder och prover data. - Ställ in fluorometer enligt följande:
- Klicka på
knappen, kommer detta att öppna fönstret Analysis Method, som visas i figur 2. 
Figur 2. Analysmetod Fönster, fliken Allmänt.
Gör följande val:- I "Measurement"-fältet, välj Fotometri från rullgardinsmenyn.
- I "Operator" anger du lämpligt operatörens namn.
- Det finns ingen anledning att skriva in information i "Instrument"-fältet. Den väljs automatiskt av programmet.
- Den "Sampling"-fältet är inaktiv när du använder mikroplattan läsaren.
- Har du några kommentarer som du kanske vill ingå i rapporten i "Kommentarer"-fältet.
- I "Tillbehör" anger du information om de tillbehör som används för detta test.
- Notera knapparna på höger sida av fönstret.
- "Load"-knappen kan ladda tidigare sparade analysmetoder.
- "Spara"-knappen kan uppdatera en uppsättning av test-parametrar eller Analysis Method tidigare sparade och laddas med samma namn.
- "Spara som"-knappen kan spara en ny uppsättning av test-parametrar eller Analysis Method under ett önskat namn.
Figur 3. Analysmetod Fönster, Quantitation fliken.- I "Kvantifiering typ"-fältet, välj våglängd. Detta indikerar fluorescensen behandlingen kommer att göras med den valda våglängden.
- I "Calibration typ"-fältet, välj 1 st ordning.
- I "antal våglängder"-fältet, välj 1.
- I "Koncentration Enhet"-fältet, skriv ng / ml.
- Lämna omarkerade rutorna för "Manuell kalibrering" och "Force kurva genom noll".
- I "siffran efter decimaltecknet"-fältet, välj 2.
- I "Nedre koncentrationsgränsen" anger du 0.
- I "övre koncentrationsgräns anger du 10000.
Klicka nu på "Instrument"-fliken och gör följande val.
Figur 4. Analysmetod fönster, Instrument på fliken- I "Data mode:"-fältet, välj fluorescens.
- Den "Hackning hastigheten"-fältet är inaktivt vid denna tid, är det endast används för fosforescens mätningar.
- I "våglängd mode"-fältet, välj Både WL fast.
- I "EX / WL1" fältet anger 480nm.
- I "EM / WL1" fältet anger 520nm.
- Alla andra fält under EX och EM är inaktiva vid den här tiden.
- I "EX slit"-fältet väljer 5.0nm från rullgardinsmenyn.
- I "EM slit"-fältet väljer 5.0nm från rullgardinsmenyn.
- Lämna omarkerade rutan framför "PMT Spänning 1-1000V" fältet.
- I "PMT Voltage"-fältet, välj 700V från rullgardinsmenyn.
- I "Auto statistik Calc. Numret" fältet väljer du 2.
- I "Replikerar" fältet väljer 1.
- I "Integration tiden"-fältet väljer 0.1s. </ Li>
- I "Delay"-fältet ange eller välja 0s.
Figur 5. Analysmetod fönstret, fliken Bildskärm.- I "Y-axeln", "Max:"-fältet, välj 10 tusen
- I "Y-axeln", "Min:"-fältet väljer du 0.
- Markera rutan till vänster om "Open databehandling efter datainsamling".
- Lämna omarkerade rutan till vänster om "Skriv ut rapport efter datainsamling", om du inte vill att en rapport ska skrivas ut automatiskt när mätvärdena är klara.
Figur 6. Analysmetod fönstret, fliken Rapport.- I "Output"-fältet, välj Skriv ut Rapport från rullgardinsmenyn. Du kan också välja "Använd Microsoft Excel" om du vill att data exporteras till Excel eller "Använd Skriv Generator ark" om du använder den valfria lägga på programmet Report Generator som gör att skapa skräddarsydda rapporter.
- Klicka på kryssrutorna för de objekt som du vill ska ingå i rapporten.
- Att spara alla de valda parametrarna i de olika flikarna i "Analysis Method", klicka igen på fliken "Allmänt" och spara dem under ett filnamn och en plats där du kan hitta dem för framtida bruk, och klicka på " OK "knappen för att stänga detta fönster.
- Detta avslutar inrätta parametrar instrumentet testet.
- Nu kommer vi att ställa in mikroplattan läsaren.
- Klicka på
knappen, som kommer att föra Fönster MPR Setup ovanpå.
Figur 7. MPR Setup fönstret Plate fliken.- Klicka på A1-läge och dra musen för att E1, klicka på
-knappen. Detta väljer ståndpunkter som skall användas för standarder. Dessa ståndpunkter kommer att markeras med grön färg. - Nu måste vi välja positioner F1 till H3 för proven. Klicka och dra musen börjar i position F1, att positionera H3 och klicka sedan på
knappen, kommer detta att lyfta fram de positioner i gul färg. - Upprepa sedan samma operation för positioner A2 till E3, att välja dessa positioner för prov mätningar.
- Nu ska vi ladda filen Kommaavgränsade variabel fil (CSV) beredd i förväg med de normer och Sample information.
Figur 8. MPR Setup fönstret, väl fliken Information.- Klicka sedan på
-knappen. En Windows Explorer-fönster öppnas där som visas i figur 9, vilket gör det möjligt att lokalisera "Tja information.csv" filen och läsa den. 
Figur 9. Laddar bra urval information.
Efter att ha laddat den "Tja information" filen kommer "Tja information" se ut som visas i figur 10
Figur 10. Loaded provbrunnen information.
- Klicka på
knappen, kommer detta att öppna fönstret Analysis Method, som visas i figur 2. 
knappen, som kommer att föra Fönster MPR Setup ovanpå. 
-knappen. Detta väljer ståndpunkter som skall användas för standarder. Dessa ståndpunkter kommer att markeras med grön färg. 
knappen, kommer detta att lyfta fram de positioner i gul färg. 
-knappen. En Windows Explorer-fönster öppnas där som visas i figur 9, vilket gör det möjligt att lokalisera "Tja information.csv" filen och läsa den. 
2. Picogreen analys Provberedning
- Bered 1x TE buffert (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA) genom att tillsätta 1 ml 20 X TE bufferttill 19 ml dI H 2 O.
- Förbered PicoGreen reagenslösningen genom tillsats av 50 mikroliter 200 X PicoGreen Reagens till 9,95 ml 1 x TE buffert.
- Förbered standarder (Lambda dsDNA) genom att göra spädningar av lager dsDNA (100 mikrogram / ml). Först förbereda en lösning av 50 mikrogram / ml dsDNA genom att tillsätta 25 mikroliter i lager dsDNA (100 mikrogram / ml) och 25 mikroliter 1 x TE buffert. Sedan förbereder standardlösningar genom att lägga till angivna volymer dsDNA och buffert som anges i tabellen nedan:
Koncentration av dsDNA Volym av dsDNA Volym av Buffer 1 mikrogram / ml 20 mikroliter av 50 mikrogram / ml dsDNA 980 mikroliter 1 X TE buffert 0,1 mikrogram / ml 100 mikroliter av 1 mikrogram / ml dsDNA 900 mikroliter 1 X TE buffert 0,01 mikrogram / ml 100 mikroliter av 0,1 mikrogram / ml dsDNA 900 mikroliter 1 X TE buffert 0,001 mikrogram / ml 100 mikroliter på 0,01 mikrogram / ml dsDNA 900 mikroliter 1 X TE buffert
3. Mätning av standarder och prov Fluorescens
- Pipettera 150 mikroliter av varje standard i brunnar A1-E1 en 96 brunnar, per Figur 7, och enligt följande tabell:
Tja Standard A1 1 mikrogram / ml B1 0,1 mikrogram / ml C1 0,01 mikrogram / ml D1 0,001 mikrogram / ml E1 1 X TE buffert - Pipettera 150 mikroliter okända prover i brunnar F1 till H3, visas i figur 7
- Häll PicoGreen lösning som framställts i steg 1,2 i ett tråg avsedda för flerkanals pipett användning. Använd en flerkanals pipett för att leverera 150 mikroliter PicoGreen lösning brunnar A1-H3. Blanda lösning och standarder försiktigt med pipett.
- Placera plattan i mörkret och vänta 2-5 minuter för reaktion att utvecklas.
4. Representativa resultat
En bra kalibreringskurva utvärderas med hjälp av olika parametrar som tillhandahålls av F-7000 program, på mätning av de normer och beräkning av kalibreringskurvan av programvaran.
Fastställandet koefficienten visar godhet passar de uppmätta normer och den beräknade kalibreringskurvan. Ju närmare värdet är "1", desto bättre passar för det uppmätta värdet och kalibreringskurva.
Om värdet är långt ifrån "1" måste standarderna mätas på nytt, beredda igen, eller lämplighet kalibreringskurvan förändrats.
Figur 11 visar ett exempel på en kalibreringskurva med en beräknad beslutsamhet koefficient = 0,99993, erhålls för kvantifiering av dsDNA använda PicoGreen färgämne.
Figur 11. Exempel på dsDNA kalibreringskurvan.
Discussion
Noggrann pipettering under beredningen av proverna, samt med hjälp av en stabil och känslig fluorescens spektrofotometer är en förutsättning för att erhålla goda och reproducerbara resultat.
I fallet med fluorescens spektrofotometer som används för detta test, föreslås det att använda 300 mikroliter slutligt prov volym i mikroplattan läsaren. Sänk volymen minskar känsligheten, och en större volym kan orsaka korskontaminering mellan brunnar.
Disclosures
Luis A. Moreno och Kendra L. Cox är anställda av Hitachi High Technologies Amerika som producerar instrument som används i denna artikel.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Distilled H2O | Reagent | |||
| Quant-iT Picogreen dsDNA Assay Kit from Invitrogen | Reagent | P7589 | ||
| Nalge Nunc Fluorescence Microplates p/n 237108 | Supply | 237108 | ||
| 12 Channel Eppendorf Micropipette | Supply | 3516677 | ||
| 1000 μL Eppendorf Pipette | Supply | |||
| 200 μL Eppendorf Pipette | Supply | |||
| 10 mL serological pipet | Supply | |||
| Aluminum foil | Supply | |||
| Pipette tips | Supply | |||
| Hitachi F-7000 Fluorescence Spectrophotometer with FL Solutions 2.1 | Equipment | 5J1-0003 | ||
| Microplate Reader Accessory for F-7000 | Equipment | 5J0-0139 |
References
- Singer, V. L., Jones, L. J., Yue, S. T., Haugland, R. P. Characterization of PicoGreen reagent and development of a fluorescence-based solution assay for double-stranded DNA quantitation. Analytical Biochemistry. 249 (2), 228-238 (1997).
