Summary
Мы разработали альтернантных задних конечностей разгрузки модель на мышах. Основным преимуществом наших задних конечностей разгрузки хвост кольцом метода по сравнению с обычными Морей-Холтон хвостовой тяги техника проста проста процедура, которая сводит к минимуму стресс на животное.
Abstract
Морей-Холтон задних конечностей разгрузки (HU) метод широко признано Национальное управление по аэронавтике и исследованию космического пространства (НАСА) наземной моделью для изучения употребления, атрофия у грызунов 4-6. Наши исследования была проведена оценка альтернантных метод золотого стандарта Морей-Холтон HU хвостовой тяги технику у мышей. Пятьдесят четыре самки мышей (4-8 мес.) Были HU в течение 14 дней (п = 34) или 28 дней (п = 20). Восстановление после HU оценивали через 3 дня нормальной ходьбе клетки следующие HU (п = 22). Возраст соответствует мышей (п = 76) служил несущие элементы управления.
До HU кольцо хвост был сформирован с 2-0 стерильных хирургических стальной проволоки, которая была передана через 5-й, 6-й или 7-й межпозвоночного дискового пространства и формы в кольцо, из которых мышам было приостановлено. Позвоночный место для хвоста кольцо было выбрано надлежащим баланса массы животного тела, не мешая дефекации.
Мы определили успех этой новой технологии HU путем оценки массы тела до и после HU, степень камбаловидной атрофия, и надпочечников масса следующие HU. Масса тела мышей до HU (24,3 ± 2.9g) существенно не падение сразу после 14г Ху (22,7 ± 1.9g), 28д Ху (21,3 + 2.1g) или после восстановления 3-х дней (24,0 ± 1,8 г) . Камбаловидной мышечной массы значительно снизился (-39,1% и -46,6%) после HU в течение 14 дней и 28 дней соответственно (р <0,001). После 3 дней с момента массового восстановления камбаловидной значительно увеличилась до 74% от контрольных значений. Надпочечников веса мышей HU не отличались по сравнению с контрольными мышами.
Успех нашего метода HU романа о чем свидетельствует содержание животных массы тела, сопоставимые надпочечников веса железы и камбаловидной атрофии следующие HU, соответствующих ожидаемым значениям литературе 2, 7, 8. Основными преимуществами этого метода HU относятся: 1) простота хвост проверки в ходе подвески, 2) уменьшилась вероятность синюшная, воспаление и / или некротические хвостов часто наблюдаются с хвостом-лентой и HU, 3) нет возможности мышей жевательной тяги ленты и выходит из аппарата подвески и 4) и быстрое восстановление нормальной жизнедеятельности клетки сразу после HU.
Protocol
Предварительно хирургии инструменты / Материалы
- Кусачки / Клещи
- Марля 2 х 2 "колодки
- Грелка-подушка
- Серебряные палочки нитрата
- Стерильные хирургические перчатки
- Изофлюрана ингаляционного анестетика
- Хлоргексидин глюконат 4% (Антисептические хирургических скраб)
- Стерильный хирургический шов 2-0 сталь
- 25 х 5 / 8 иглы (автоклавного)
- Hemostat (автоклавного)
- Хирургический шовный стали
Процедура Хирургия
- Создать стерильные области. Следуйте стерильные процедуры.
- Обезболить мышь с 2 - 3% изофлуран.
- Место мыши на грелку.
- Скраб хвост с Хлоргексидин раствор.
- Найдите 5, 6 или 7-й межпозвонкового пространства (между двух костей шишки на хвост, начать отсчет с конца волос на теле, у основания хвоста).
- Используйте Hemostat и 25G иглу, чтобы сделать пилотное отверстие между двумя позвонками, в межпозвонкового пространства.
- Используйте кусачки, чтобы перерезать стали шва 10 см в длину.
- Удалите иглу и вставьте стали шва через отверстие, 5 см шва на любом конце хвоста.
- Каждая сторона хвоста должны иметь + 5 см от шва.
- Место большим пальцем кончик на хвосте.
- Используйте свою свободную руку и ветер стали шва на кончик пальца и крутить концы образуют большой цикл. Раны или круговую часть должна быть + 3 мм длиной.
- Удалить пальцем.
- Зажим одной нити шва с кровоостанавливающего и согните ее в меньшую петлю, конец которой присоединен как можно ближе к оригинальным вариантом оригинального большого цикла.
- Отрежьте лишнюю проволоку, и согните витой назад.
- Если есть избыток кровотечение, вы можете остановить его с серебряными палочками нитратов.
- Выключите изофлуран и место мышь в одной клетке дома, чтобы восстановить в течение 5-7 дней до задних конечностей разгрузки. Хвост кольцами запутаться, если более одного мышь размещены вместе.
1. Процедура выгрузки задних конечностей
Материалы
- Размер 10-24 X 4 крепежных винта, по одному на животное.
- Нейлон контргайку размер 10 - 24, по одному на животное.
- Крыло орех размером 10 X 24, два на одно животное.
- Стиральная машина размером ¼ X 1, два на одно животное.
- Рыбалка поворотный с карабином размер № 6, 1-11/16 ", и одно на одно животное.
- Металл швейная машина бобину. Один на животное.
- Малый скрепки для S-образный крюк, по одному на животных
- Клещи.
- 2 х 2 "марлю.
- 2 "черного зажимов связующего бумаги.
- Клейкая лента / лаборатории ленты.
- 1-3/8 "покрытием прорези стальной прут, который слегка выступает за полную длину клетки
- 50см х 40см х 20см клетку (клетка крысы).
- Бутылку воды с присоединительным трубки.
- Из нержавеющей стальной проволоки, П-образные для поддержки бутылку воды.
Кейдж установки
- Положите 1-38 "покрытием прорези стальной прут поверх клетке, и прикрепить ее временно вниз с клейкой лентой.
- Винт 1 гайку, чтобы крепежный винт, вставьте шайбу и вставьте желоб крепежный винт прорези стальной пластины ± 15 см от края клетки.
- Добавьте еще шайбу и гайку. Затяните оба крыла орехи, но не в полной мере становятся более жесткими, как это будет необходимо делать корректировки позже.
- Вставьте крепежный винт через центральное отверстие катушки.
- Для предотвращения бобины от падения, винтовые гайки нейлона блокировки до конца крепежный винт. Катушка должна поворотный свободно.
- Вставьте карабином от рыбалки поворотной через нижнюю часть бобины.
- Используйте плоскогубцы для формирования S-образный крюк от скрепки. (Вырезать 2 см от скрепки для бумаг, чтобы сформировать крюк).
- Вставьте один конец S-образный крюк через дыру рыбалки поворотные и щепотку она закрыта с плоскогубцами.
- Место П-образные проволоки, параллельно крепежный винт, на внутренней стороне клетки, и согните концы назад к уровню поддержки полную бутылку воды.
- Вставьте бутылку с водой в П-образной проволоки, с spicket вниз, не касаясь дна.
- Бенд 2 "связующего зажим открыто, так что они не могут закрыть закрыть. Ровно столько напряженность провести от 3 до 4 кусочков пищи в нем без его выпадения. Это мешает сила зажима при дроблении пищи, или подавляя мышь носом.
- Место 3 до 4 шт грызунов чау в связующем зажимом.
Разгрузка задних конечностей мыши
- Вставьте открытый конец S-образный крюк через меньшее кольцо хвост кольцом.
- Отрегулируйте высоту мыши путем ужесточения или ослабления нижнего крыла гайку на крепежный винт. Нижних конечностей не должны быть веса подшипника. После оптимальной высоты достигается затяните верхнюю гайку крыла.
- Перемещение бутылку воды, и П-образной проволоки так, чтобы мыши не могут подняться на spicket с его задних конечностей. Безопасные бутылку воды с клейкой лентой в сторону клетки.
- Позиция связующего зажим с пищей на дно клетки так, что мышь не может подняться на него; прикрепить ее вниз с клейкой лентой.
- Повторите ту же процедуру, если больше чем одно животное задних конечностей выгружается на другой стороне клетки. Дом двух животных в клетке; пространства животных, чтобы они могли почти касаются друг друга.
- Используйте 2 X 2 марли, чтобы свободно обернуть хвост мыши на рыбу поворотными кулаками. Используйте небольшой кусочек ленты, чтобы обернуть вокруг марли, обеспечив марли, чтобы хвост. Этот шаг важен для предотвращения хвост из опустив вниз, что приводит к объединению крови в кончик хвоста, и что хвост становится некротической.
- Добавьте небольшое количество постельных принадлежностей початка к клетке. Не добавляйте слишком много постельных принадлежностей в противном случае мышь от насыпи постельные принадлежности и попытка загрузить задние конечности на подстилке.
2. Представитель Результаты:
Установить успех хвост кольцом техники HU мы измерили вес тела животного до операции кольцом хвост, и до и после HU и восстановления; камбаловидной мышечную массу, а масса надпочечников во всех группах.
Тело веса мышей в течение всего эксперимента показаны на рисунке 1. Тело веса мышей до операции хвост кольцом (24,7 ± 3,5 г) существенно не различались через 5 дней восстановления от операции хвост кольцом (24,3 ± 2.9g) до HU. Не было масса тела значительно снижаться сразу после 14 дней HU (22,7 ± 1.9g), 28 дней HU (21,3 + 2.1g) или через 3 дня восстановления после HU (24,0 ± 1,8 г). Хотя HU на 14 и 28 дней привело к небольшому (-6,8% и 12%), но без значительной потери массы тела, мыши полностью выздоровели которые они занимали до HU массы тела через 3 дня на восстановление. Потребление продуктов питания для амбулаторного контрольных мышей и мышей HU показано на рисунке 3. Среднесуточное потребление пищи не отличалась у мышей HU более 28 дней по сравнению с контрольной группой.
Мы наблюдали значительные камбаловидной атрофии мышц следующие HU на 14 и 28 дней (-39,1% и -46,6%) указали, эффективная процедура HU (рис. 2). Кроме этого степень атрофии согласуется с ожидаемым литературе значений в течение 2-4 недель 2 HU, 7, 8. После 3 дней с момента восстановления HU камбаловидной масса значительно увеличилась до 74% от контрольных значений. Камбаловидной массы в восстановлении группы было значительно больше, чем обе группы HU, но все же значительно меньше, чем амбулаторное контрольных животных.
Надпочечников веса были измерены как показатель животного стресс; как левого и правого надпочечника вырезали и взвешивали. Средний вес были сопоставимы по контролю и HU мышей мышей во всех группах (рис. 4).
Ранее на крысах было показано, что для успеха количество животных в начале HU по сравнению с числом животных, которые завершили HU, не выходя из подвески аппарата (из-за животных жевательная через хвостовой тяги ленты) было 10 из от 12 использованием Морей-Холтон техники 1. Ни одна из мышей (п = 54) в данном исследовании, когда-либо сошел с подвеской до завершения периода HU. Мы тем не менее, имеют одну мышь, которая разработала сильно воспаленный хвост. При воспалении стала очевидной, мы удалили хвост кольцом, чтобы воспаленный участок, чтобы зажить, и впоследствии помещен еще один хвост кольцом для завершения продолжительность HU.
В прошлом, когда мы использовали Морей-Холтон метод HU, мы обычно устранения 1-2 мышей / группу, потому что они выходят из подвески аппарата. С след кольцо метода не было эпизодов мышей случайно выходит из аппарата HU в период HU в течение 14 или 28 дней (п = 54 мышей).
Рисунок 1. Масса тела Изменения (среднее ± стандартное отклонение). Сокращения: CON: несущие контрольных мышей (п = 76); Предварительно HU: все мыши до HU (п = 54); HU14: мыши задних конечностей выгружен в течение 14 дней (п = 34); HU28: мыши задних конечностей нагрузок в 28 дней (п = 20); REC: задние конечности выгружен мышей позволили клетке восстановиться в течение 3 дней (п = 22). Статистически значимых различий в массе тела были обнаружены между группами.
Рисунок 2. Камбаловидной мышечная атрофия (среднее ± стандартное отклонение). Сокращения: CON: несущие контрольных мышей (п = 76); HU14: мыши задних конечностей выгружен в течение 14 дней (п = 34); HU28: мыши задних конечностей выгружен в течение 28 дней (п = 20) и REC: задние конечности выгружен мышей позволили к клетке восстановиться в течение 3 дней (п = 22). * Значительно отличается (р <0,001), чем несущие контроля (CON). δSignificantly различные (р <0,01), чем обе группы HU.
467fig3.jpg "ALT =" Рисунок 3 "/>
Рисунок 3. Потребление продуктов питания (среднее ± стандартное отклонение). Среднесуточное потребление пищи (г / день) в течение несущие и задних конечностей разгрузки. Сокращения: несущие контрольных мышей (п = 76); HU: мыши задних конечностей unloaded14 - 28 дней. Нет существенных различий между CON и HU групп не наблюдалось.
Рисунок 4. Надпочечников Масса (среднее ± стандартное отклонение). Сокращения: CON: несущие контрольных мышей (п = 76); HU14: мыши задних конечностей выгружен в течение 14 дней (п = 34); HU28: мыши задних конечностей выгружен в течение 28 дней (п = 20) и REC: задние конечности выгружен мышей позволили к клетке восстановиться в течение 3 дней (п = 22). Никаких существенных различий не наблюдалось в обеих группах.
Discussion
Мы оценили альтернативный способ разгрузки задних конечностей мышей, которые мы определили как очень успешные. Хвост кольцом методом, как описано здесь была использована для долгосрочного задних конечностей подвески, а также изучить восстановления после HU. Под каждым из этих условий, не было никаких доказательств неприспособленность о чем свидетельствует стабильный прием пищи, вес тела, надпочечников и веса мышей. Этот хвост кольцом HU техника проста в исполнении и может быть легко объединена с очень мало хирургической практике.
Есть несколько преимуществ хвост кольцом метода по сравнению с традиционными Морей-Холтон 5, 6 методом. Во-первых, кожа и сайт кольца имплантации на том, что хвост всегда видны, поэтому, если возникают проблемы, очевидно, сразу же, а не только в конце срока приостановления. Во-вторых, животные не в состоянии выбраться из подвески аппарата в любое время в течение HU, что исключает необходимость вынести определение о том, чтобы держать мышь или не в наборе данных. Кроме того, мыши не беспокоить кольцо аппарата и, когда они освобождаются от HU для восстановления, они не вмешиваться в их хвостах, что позволяет бесшовные фазе восстановления после HU. Наконец, задние конечности выгружен мышей хвост кольцом метод поддержания своего веса лучше, чем мыши, задние конечности выгружается Морей-Холтон хвостовой тяги техники. В наших руках после 14 дней HU мы наблюдали небольшой (-6,8%), но без значительной потери массы тела. В то время как Ingalls и соавт. Наблюдается значительный -12% снижение массы тела у мышей после 14 дней HU на Мори-Холтон метод 3. Хотя Ingalls не сообщали надпочечников весом, кажется, что наш хвост кольцом метод дает меньшую нагрузку на мышь (надпочечников весов в нашу мышей HU не отличаются чем в контрольной группе) и лучшее обслуживание массы тела по всему задних конечностей разгрузки период.
Таким образом, метод хвост кольцом задних конечностей разгрузка была разработана и испытана на мышах HU на 14 и 28 дней, а на мышах вернулся в клетку восстановления в течение 3 дней после HU. На основе надпочечников веса, массы тела, приема пищи, мыши, похоже, адаптировались к хвосту кольцо аппарата. Хвост кольцом задних конечностей разгрузки метод является полезным, простой альтернативой традиционным Морей-Холтон техника задних конечностей разгрузки.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить Андрея J Данн, выдающимся студентом исследования в нашей лаборатории, за его техническую помощь и уход за животными. Национальный институт здравоохранения грант HD058834 и университета Миссури Науки о жизни стипендий финансируемых эту работу.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Wire cutters/pliers | Ace Hardware | 84-056 | |
| Gauze | Fisher Scientific | 22-037-901 | |
| Heating pad | Sunbeam | Z-1228-001 | |
| Silver nitrate applicators | ARZOL | 0001-2 | |
| Isoflurane,USP | Novaplus | NDC 0409-3292-49 | |
| Chlorhexidine Gluconate 4% | Purdue Products L.P. | NDC 67618-200-01 | |
| Sterile 2-0 surgical steel suture | Ethicon Inc. | SS-28 | |
| 25 X 5/8 A gauge needle | Terumo Medical Corp. | NN 2516R | |
| Hemostat/ needle holder | Fine Science Tools | 12500-12 | |
| Size 10-24 X 4 machine screws | Hillman The Fastener Center | 90272 | |
| Nylon lock nut size 10 X 24 | Hillman The Fastener Center | 180141 | |
| Wing nut size 10 X 24 | Hillman The Fastener Center | 180243 | |
| Fender Washer size ¼ X 1 | Hillman The Fastener Center | 290012 | |
| Fishing swivel with snap hook size #6, 1-11/16” | Bass Pro Shop | 38-481-554-01 | |
| Metal sewing machine bobbin. | Singer Instruments | 45785 | |
| Paper clip | Office Depot | 221720 | |
| 2” black paper binder clamps. | Office Depot | 308957 | |
| Scotch Multi-Use Duct Tape | Office Depot | 790710 | |
| 1-3/8” Plated slotted steel bar | Home Depot | 548932 | Extends slightly beyond the full length of the cage |
| 50cm X 40cm X 20cm cage (rat cage | Alternative Design Manufacturing | RC88D-PC | |
| Water Bottle | Alternative Design Manufacturing | WB16FS | |
| Stainless Steel wire | Small Parts, Inc. | SWX-4029 | U-shaped wire to support water bottle |
References
- Brown, M., Foley, A. M., Hasser, E. M., Foley, C. M. An alternative method for hindlimb unweighting. J Gravitational Physiol. 12, 43-50 (2005).
- Fitts, R. H., Metzger, J. M., Riley, D. A., Unsworth, B. R. Models of disuse: a comparison of hindlimb suspension and immobilization. J Appl Physiol. 60, 1946-1953 (1986).
- Ingalls, C. P., Warren, G. L., Armstrong, R. B. Intracellular Ca2+ transients in mouse soleus muscle after hindlimb unloading and reloading. Journal of Applied Physiology. 87, 386-390 (1999).
- Morey, E. Spaceflight and bone turnover: correlation with a new rat model of weightlessness. BioScience. 29, 168-172 (1979).
- Morey-Holton, E. R., Globus, R. K. Hindlimb unloading of growing rats: a model for predicting skeletal changes during space flight. Bone. 22, 83-88 (1998).
- Morey-Holton, E. R., Globus, R. K. Hindlimb unloading rodent model: technical aspects. J Appl Physiol. 92, 1367-1377 (2002).
- Thomason, D. B., Booth, F. W. Atrophy of the soleus muscle by hindlimb unweighting. J Appl Physiol. 68, 1-12 (1990).
- Thomason, D. B., Herrick, R. E., Surdyka, D., Baldwin, K. M. Time course of soleus muscle myosin expression during hindlimb suspension and recovery. J Appl Physiol. 63, 130-137 (1987).
