Summary
Hemos desarrollado una extremidad posterior alternante descarga modelo en ratones. La principal ventaja de nuestro miembro posterior descarga de cola de anillo sobre el método convencional de Morey-Holton cola de tracción técnica es un procedimiento simple y directo que reduce el estrés en el animal.
Abstract
El Morey-Holton miembro posterior descarga (HU) es un método ampliamente aceptado Nacional de Aeronáutica y del Espacio (NASA) con base en tierra modelo para el estudio de la atrofia por desuso, en los roedores 4-6. Nuestro estudio se evaluó un método alternante para el estándar de oro Morey-Holton HU-cola tracción técnica en ratones. Cincuenta y cuatro hembras (4-8 meses). HU fueron por 14 días (n = 34) o 28 días (n = 20). La recuperación de la HU se evaluó después de 3 días de deambulación jaula normal después de HU (n = 22). De entre los ratones emparejados (n = 76) sirvieron como controles que soportan peso.
Antes de HU un anillo de la cola se formó con un 2-0 de alambre de acero quirúrgico estéril que se ha pasado a través de la 5 ª, 6 ª o 7 ª intervertebral espacio en disco y en forma de un anillo de los ratones que fueron suspendidos. Ubicación vertebral de la cola de anillo fue seleccionado para equilibrar adecuadamente el peso corporal de los animales sin interferir con la defecación.
Se determinó el éxito de esta nueva técnica de HU al evaluar el peso corporal antes y después de HU, el grado de atrofia del músculo sóleo y HU masa suprarrenal siguiente. El peso corporal de los ratones antes de la HU (24,3 ± 2.9g) no modificó significativamente descenso inmediatamente después de 14d de HU (22,7 ± 1,9 g), 28d de HU (21,3 + 2,1 g) o después de la recuperación de 3 días (24,0 ± 1,8 g) . La masa del músculo sóleo se redujo significativamente (-39,1%, -46,6% y) después de HU durante 14 días y 28 días respectivamente (p <0,001). Después de 3 días de cobro masivo sóleo significativamente mayor al 74% de los valores de control. Pesos suprarrenales de ratones HU no fueron diferentes en comparación con ratones control.
El éxito de nuestro método HU novela se refleja en el mantenimiento del peso corporal del animal, comparable pesos glándula suprarrenal, y la atrofia sóleo siguientes HU, que corresponden a los valores de la literatura esperado 2, 7, 8. Las principales ventajas de este método HU incluyen: 1) la facilidad de examen cola durante la suspensión, 2) disminución de la probabilidad de las colas de cianótico, inflamado, y / o necrótico observado con frecuencia con la cola con una cinta adhesiva y HU, 3) no hay posibilidad de ratones masticando la tracción la cinta y sale del aparato de suspensión, y 4) la recuperación rápida y la actividad normal inmediatamente después de la jaula HU.
Protocol
Cirugía Pre-Instrumentos / Materiales
- Cortadoras de alambre / alicates
- Gasa de 2 x 2 "almohadillas
- Almohadilla eléctrica
- Palos de nitrato de plata
- Guantes quirúrgicos estériles
- Isoflurano anestésicos por inhalación,
- El gluconato de clorhexidina al 4% (lavado quirúrgico antiséptico)
- Estéril 2-0 sutura de acero quirúrgico
- 25 x 5 / 8 Un indicador de aguja (autoclave)
- Hemostático (autoclave)
- Suturas quirúrgicas de acero
Cirugía Procedimiento
- Crear un campo estéril. Siga el procedimiento estéril.
- Anestesiar ratón con 2 - 3% isoflurano.
- Coloque el ratón sobre el cojín eléctrico.
- Scrub cola con solución de clorhexidina.
- Localice 5, 6, o 7 º espacio intervertebral (entre dos protuberancias óseas en la cola, empieza a contar desde el final de vello corporal, en la base de la cola).
- Use pinza hemostática y aguja 25G para hacer un agujero piloto entre dos vértebras, en el espacio intervertebral.
- Use los cortadores de alambre para cortar la sutura de acero de 10 cm de largo.
- Se retira la aguja e inserte sutura de acero a través del agujero de 5 cm de sutura en cada extremo de la cola.
- Cada lado de la cola debe tener + 5 cm de sutura.
- Coloque la punta del pulgar a la cola.
- Use su mano libre y el viento de la sutura de acero en la punta de su dedo pulgar y gire los extremos para formar un lazo grande. La parte herida o circular debe ser + 3 mm de largo.
- Retire el dedo pulgar.
- Abrazadera de un hilo de sutura con la pinza hemostática y se dobla en un lazo más pequeño, al final del cual se adjunta en la mayor medida posible a la torcedura en el gran circuito original.
- Cortar el exceso de cable, y la forma del cable trenzado.
- Si hay algún sangrado excesivo, se puede detener con los palos de nitrato de plata.
- Apagar el ratón isoflurano y el lugar en una jaula sola casa a recuperarse durante 5-7 días antes de la extremidad posterior descarga. Los anillos de la cola se enreda si más de un ratón se encuentra junto.
1. Miembro posterior descarga Procedimiento
Materiales
- Tamaño 10.24 x 4 tornillos de la máquina, uno por cada animal.
- Tuerca de bloqueo de nylon tamaño de 10 a 24, uno por cada animal.
- Ala tuerca de tamaño 10 X 24, dos por cada animal.
- Lavadora ¼ x 1, dos por cada animal.
- Pesca giratoria con el tamaño del gancho de seguridad # 6, 1-11/16 ", y uno por animal.
- De metal máquina de coser de bolillos. Uno por animal.
- Clip pequeño de S-en forma de gancho, uno por cada animal
- Alicates.
- 2 x 2 "de gasa.
- 2 "negro abrazaderas de papel cuaderno.
- Cinta adhesiva / cinta de laboratorio.
- 1-3/8 "chapado en acero ranurados barra que se extiende poco más allá de la longitud de la jaula
- 50cm X 40cm X 20cm jaula (jaula de ratas).
- Botella de agua con tubo doblado.
- Alambre de acero inoxidable, en forma de U para apoyar una botella de agua.
Jaula de la instalación
- Sentar las 1-38 "chapado barra de acero con ranuras en la parte superior de la jaula, y la cinta que temporalmente con cinta adhesiva.
- Un tornillo de palomilla al tornillo, una arandela, e introduzca el tornillo a través de la placa de acero ranurados ± 15 cm del borde de la jaula.
- Añadir otra arandela y tuerca de mariposa. Apretar las tuercas de ala, pero no apriete, ya que será necesario hacer ajustes posteriores.
- Inserte el tornillo de la máquina a través del agujero del centro de la bobina.
- Para evitar que la bobina se caiga, tornillo de la tuerca de fijación de nylon para el final del tornillo de la máquina. La bobina debe girar libremente.
- Inserte el gancho de seguridad giratorio de la pesca a través de la parte inferior de la bobina.
- Utilice unos alicates para formar un gancho en forma de S del clip. (Corte 2 cm del clip en forma de anzuelo).
- Inserte un extremo del gancho en forma de S a través del agujero de la pieza giratoria y una pizca de pesca se cerró con las pinzas.
- Coloque el cable en forma de U, en paralelo al tornillo de la máquina, en el interior de la jaula de lado, y doble los extremos de nuevo a apoyar una botella llena de agua.
- Inserte la botella de agua en el alambre en forma de U, con la Spicket hacia abajo, pero sin tocar el fondo.
- Doble las dos "carpeta pinza abierta, por lo que no puede cerrar cerca. Sólo la tensión suficiente para contener 3 a 4 piezas de los alimentos en ella sin que se caiga. Se trata de la prevención de la fuerza de la pinza de la molienda del alimento, o poner coto a la nariz del ratón.
- Lugar 3 a 4 piezas de roedores chow en la pinza aglutinante.
Miembro posterior descarga de ratón
- Inserte el extremo abierto del gancho en forma de S en el anillo más pequeño del anillo de la cola.
- Ajuste la altura del ratón por apretar o aflojar la tuerca inferior del tornillo de la máquina. Las extremidades inferiores no se debe soportar peso. Una vez que la altura óptima se logra apretar la tuerca superior del ala.
- Vuelva a colocar la botella de agua, y el alambre en forma de U, para que el ratón no se puede subir a la Spicket con sus patas traseras. Asegure la botella de agua con cinta adhesiva a un lado de la jaula.
- Coloque la abrazadera carpeta con los alimentos en la parte inferior de la jaula para que el ratón no se puede subir a ella, la cinta hacia abajo con cinta adhesiva.
- Repita el mismo procedimiento si más de un animal es miembro posterior descarga en el otro lado de la jaula. Casa de dos animales por jaula, el espacio de los animales de modo que casi pueden tocarse.
- Utilice el 2 X 2 gasa para envolver sin apretar la cola del ratón sobre el giro de pescado. Use un pedazo pequeño de cinta para envolver alrededor de la gasa, asegurando la gasa hasta la cola. Este paso es importante para evitar que la cola de la caída hacia abajo, dando lugar a la acumulación de sangre en la punta de la cola y que la cola de necrosarse.
- Agregue una pequeña cantidad de camas mazorca a la jaula. No añada cama demasiado de lo contrario el ratón de un montón de ropa de cama y tratar de cargar patas traseras en las camas.
2. Los resultados representativos:
Para establecer el éxito de la técnica de la cola de anillo HU se midieron el peso corporal del animal antes de la cirugía anillo de cola, y antes y después de Hungría y la recuperación, la masa del músculo sóleo y masa suprarrenal en todos los grupos.
Peso corporal de los ratones durante todo el experimento se muestran en la Figura 1. Peso corporal de los ratones antes de la cirugía de cola de anillo (24,7 ± 3,5 g) no fueron significativamente diferentes después de 5 días de recuperación de la cirugía anillo de cola (24,3 ± 2.9g) antes de la HU. Ni el peso corporal de manera significativa disminución inmediatamente después de los 14 días de HU (22,7 ± 1,9 g), 28 días de HU (21,3 + 2,1 g) o la recuperación después de 3 días a partir de HU (24,0 ± 1,8 g). Aunque HU de 14 y 28 días dio lugar a una pequeña pérdida (-6,8% y el 12%), pero no significativa en la masa corporal, los ratones completamente recuperado de su pre-HU peso corporal después de 3 días de recuperación. El consumo de alimentos para los ratones control ambulatorio y ratones HU se muestra en la Figura 3. Ingesta diaria de alimentos no fue diferente en ratones HU durante 28 días en comparación con los controles.
Se observó una atrofia significativa músculo sóleo siguientes HU de 14 y 28 días (-39,1%, -46,6% y) lo que indica un procedimiento eficaz de HU (Figura 2). Además, este grado de atrofia es coherente con los valores esperados para la literatura de 2-4 semanas de HU 2, 7, 8. Después de 3 días de la recuperación de la HU sóleo de masas aumentó significativamente a 74% de los valores de control. La masa del músculo sóleo en el grupo de recuperación fue significativamente mayor que los dos grupos HU, pero sigue siendo significativamente menor que los animales control ambulatorio.
Pesos suprarrenales se mide como un indicador del estrés de los animales, tanto de las glándulas suprarrenales derecha e izquierda fueron extirpados y pesado. El peso promedio eran comparables para el control de los ratones y los ratones HU en todos los grupos (Figura 4).
Previamente en ratas que han demostrado que la tasa de éxito en el número de animales al inicio de HU en comparación con el número de animales que han completado HU sin salir de los aparatos de suspensión (debido a los animales de mascar a través de la cinta de cola de tracción) fue de 10 a de 12, usando la técnica de Morey-Holton 1. Ninguno de los ratones (n = 54) en este estudio que se ha bajado de la suspensión antes de la finalización del período de HU. Lo hicimos sin embargo, tienen un ratón que cola que se desarrolló severamente inflamada. Cuando la inflamación se hizo evidente, hemos eliminado el anillo de la cola para que la zona inflamada para curar, y posteriormente colocó otro anillo de la cola para completar la duración de la HU.
En el pasado, cuando se ha utilizado el método de Morey-Holton del HU, por lo general eliminar 1-2 ratones / grupo, ya que salen del aparato de suspensión. Con el método de camino del anillo no hubo episodios de ratones sin querer salir del aparato HU durante el período de HU de 14 o 28 días (n = 54 ratones).
Figura 1. Cambios de peso corporal (media ± DE). Abreviaturas: CON: levantamiento de peso ratones de control (n = 76), Pre-HU: todos los ratones antes de la HU (n = 54); HU14: extremidades posteriores ratones descargado durante 14 días (n = 34); HU28: miembro posterior descarga de los ratones 28 días (n = 20), REC: ratones miembro posterior descarga permite a la jaula de recuperarse durante 3 días (n = 22). No hubo diferencias significativas en el peso corporal se observaron entre los grupos.
Figura 2. Sóleo atrofia muscular (media ± DE). Abreviaturas: CON: levantamiento de peso ratones de control (n = 76); HU14: extremidades posteriores ratones descargado durante 14 días (n = 34); HU28: extremidades posteriores ratones descargado durante 28 días (n = 20) y REC: ratones miembro posterior descarga permitidos a la jaula de recuperarse durante 3 días (n = 22). * Significativamente diferente (p <0,001) que el control de carga de peso (CON). δSignificantly diferentes (p <0,01) que los dos grupos HU.
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Figura 3. Consumo de Alimentos (media ± DE). Ingesta diaria de alimentos (g / día) durante el levantamiento de peso y descarga de extremidades inferiores. Abreviaturas: levantamiento de peso ratones de control (n = 76), HU: ratones extremidades inferiores unloaded14 - 28 días. No se observaron diferencias significativas entre los CON y los grupos de HU se observaron.
Figura 4. Masa suprarrenal (media ± DE). Abreviaturas: CON: levantamiento de peso ratones de control (n = 76); HU14: extremidades posteriores ratones descargado durante 14 días (n = 34); HU28: extremidades posteriores ratones descargado durante 28 días (n = 20) y REC: ratones miembro posterior descarga permitidos a la jaula de recuperarse durante 3 días (n = 22). No se observaron diferencias significativas entre los grupos.
Discussion
Se evaluó un método alternativo de ratones miembro posterior descarga, lo que nos decidimos a tener mucho éxito. El método de cola de anillo como se describe aquí se utiliza para la suspensión de las extremidades traseras a largo plazo, y estudiar la recuperación después de HU. En cada una de estas condiciones, no hubo evidencia de falta de adaptación como se evidencia por la ingesta de alimentos estable, el peso corporal, y los pesos suprarrenales de los ratones. Esta técnica de cola de anillo HU es fácil de realizar y se pueden incorporar fácilmente con la práctica quirúrgica muy poco.
Hay varias ventajas del método de cola de anillo en comparación con el tradicional Morey-Holton 5, 6 método. En primer lugar, la piel y el lugar de la implantación del anillo de la cola que siempre son visibles, por lo que si surgen problemas, es evidente de inmediato, no sólo al final del período de suspensión. En segundo lugar, los animales no son capaces de salir del aparato de suspensión en cualquier momento durante el HU, obviando la necesidad de hacer una determinación de si se debe mantener un ratón o no en el conjunto de datos. Además, los ratones no se molestan en el aparato de anillo y cuando son liberados de HU para la recuperación, no interferir con sus colas, lo que permite una fase de recuperación sin problemas después de HU. Finalmente, los ratones miembro posterior descarga con el método de cola de anillo mantener su peso corporal mejor que los ratones miembro posterior descarga por el Morey-Holton cola de tracción técnica. En nuestras manos después de 14 días de HU se observó una pequeña pérdida (-6,8%), pero no significativa en la masa corporal. Mientras que Ingalls et al. Observaron una disminución significativa -12% del peso corporal en ratones después de 14 días de HU por el método de Morey-Holton 3. Aunque Ingalls no informó pesos suprarrenales, parece que nuestra cola-ring método confiere menos tensión en el ratón (pesos suprarrenales en nuestros ratones HU no son diferentes que en los controles) y un mejor mantenimiento del peso corporal durante el período de extremidades inferiores descarga.
En resumen, un método del anillo de la cola de descarga de extremidades inferiores fue desarrollado y probado en ratones HU de 14 y 28 días, y en los ratones volvieron a la recuperación de la jaula de 3 días después de HU. Sobre la base de pesos suprarrenales, la masa corporal y la ingesta de alimentos, los ratones parecen haberse adaptado bien a la cola del aparato de anillo. La extremidad posterior de cola de anillo método de descarga es una alternativa útil, sencilla de la técnica tradicional de Morey-Holton miembro posterior descarga.
Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Los autores desean agradecer a Andrew J Dunn, un destacado estudiante de pregrado de investigación en nuestro laboratorio, por su asistencia técnica y el cuidado de los animales. El Instituto Nacional de Salud de subvención HD058834 y la Universidad de Missouri Ciencias de la Vida de Becas financiado este trabajo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Wire cutters/pliers | Ace Hardware | 84-056 | |
| Gauze | Fisher Scientific | 22-037-901 | |
| Heating pad | Sunbeam | Z-1228-001 | |
| Silver nitrate applicators | ARZOL | 0001-2 | |
| Isoflurane,USP | Novaplus | NDC 0409-3292-49 | |
| Chlorhexidine Gluconate 4% | Purdue Products L.P. | NDC 67618-200-01 | |
| Sterile 2-0 surgical steel suture | Ethicon Inc. | SS-28 | |
| 25 X 5/8 A gauge needle | Terumo Medical Corp. | NN 2516R | |
| Hemostat/ needle holder | Fine Science Tools | 12500-12 | |
| Size 10-24 X 4 machine screws | Hillman The Fastener Center | 90272 | |
| Nylon lock nut size 10 X 24 | Hillman The Fastener Center | 180141 | |
| Wing nut size 10 X 24 | Hillman The Fastener Center | 180243 | |
| Fender Washer size ¼ X 1 | Hillman The Fastener Center | 290012 | |
| Fishing swivel with snap hook size #6, 1-11/16” | Bass Pro Shop | 38-481-554-01 | |
| Metal sewing machine bobbin. | Singer Instruments | 45785 | |
| Paper clip | Office Depot | 221720 | |
| 2” black paper binder clamps. | Office Depot | 308957 | |
| Scotch Multi-Use Duct Tape | Office Depot | 790710 | |
| 1-3/8” Plated slotted steel bar | Home Depot | 548932 | Extends slightly beyond the full length of the cage |
| 50cm X 40cm X 20cm cage (rat cage | Alternative Design Manufacturing | RC88D-PC | |
| Water Bottle | Alternative Design Manufacturing | WB16FS | |
| Stainless Steel wire | Small Parts, Inc. | SWX-4029 | U-shaped wire to support water bottle |
References
- Brown, M., Foley, A. M., Hasser, E. M., Foley, C. M. An alternative method for hindlimb unweighting. J Gravitational Physiol. 12, 43-50 (2005).
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