Summary
RNA enterferans (RNAi) dsRNA beslenmemiş keneler içine enjeksiyon için bir yöntem açıklanmıştır. RNAi genetik manipülasyon diğer yöntemlerin kullanımı sınırlı kalmıştır keneler en yaygın olarak kullanılan gen susturma tekniği.
Abstract
Keneler evcil ve vahşi hayvanların ve insanların zorunlu hematophagous ektoparazit ve insan hastalıkları 1 ve en önemli vektörler vektörler sığır sektöründe dünya çapında 2 etkileyen sivrisinekler için dünyada ikinci olarak kabul edilir. Keneler, altsınıf Acari, sipariş Parasitiformes, alttakım Ixodida sınıflandırılır ve Arctic tropikal bölgelerde 3 dünya çapında dağıtılmaktadır . Kene istilası kontrol etmek için tüm çabalarına rağmen, bu ektoparazit 4,5, insan ve hayvan sağlığı için ciddi bir sorun olmaya devam etmektedir.
RNA enterferans (RNAi) 6, gen fonksiyonu veya etkisi metabolik yolu belirlemek amacıyla gen ekspresyonu bozulması içeren bir nükleik asit tabanlı ters genetik yaklaşım . Küçük müdahale RNA'lar (siRNA) dsRNA tetik 7-9 gibi aynı sırayla içeren sitoplazmik mRNA'ların güçlü bir dizi özel bozulması, çift iplikli RNA (dsRNA) ve sonuçları tarafından başlatılan RNAi yolun efektör moleküllerdir . DsRNA tarafından başlatılan transkripsiyon sonrası gen susturulması mekanizmaları tüm ökaryotlarda tespit edilmiştir şimdiye kadar okudu ve RNAi, fonksiyonel genomik çalışmalar ve diğer uygulamalar 10 için bir araç olarak hızla çeşitli organizmaların geliştirilmiştir .
RNAi genetik manipülasyon için alternatif yaklaşımlar mevcut değildir ya da güvenilmez 5,11 keneler ve diğer organizmalar içinde en yaygın olarak kullanılan gen susturma tekniği haline gelmiştir. Keneler genetik karakterizasyon RNAi 12,13 son başvuru tarihine kadar sınırlı olmuştur. RNAi mevcut olduğunu kısa süre içinde, bu, karakterizasyonu ve kene patojen arayüzü tarama ve kene koruyucu antijenler 14 karakterizasyonu kene gen fonksiyonu eğitim için değerli bir araç olduğunu kanıtlamıştır. Burada, içine dsRNA beslenmemiş keneler enjeksiyon yoluyla RNAi için bir yöntem açıklanmıştır. Bu deneysel bir yaklaşım elde edilen bilgi, anlayış ve temel biyolojik sistemlerin kene istilası kontrolü ve kene kaynaklı patojenlerin 15-19 bulaşmasını önlemek için aşı geliştirme belirgin katkısı olacağı muhtemeldir .
Protocol
1. DsRNA, Üretimi.
- DsRNA in vitro transkripsiyon ve sentez (örneğin, Dermacentor subolesin oligonükleotid primerler D8AAT75 variabilis için T7 promotor dizisinde içeren oligonükleotid primerler sentez:
5'-TAATACGACTCACTATAGGGTACTGACTGGGATCCCCTGCACAGT-3 've D8DVT73: 5'-TAATACGACTCACTATAGGGTACTCGAGCTTGGTGGAAAGGACG-3'). - RT-PCR her oligonükleotid astar ve kene toplam RNA 1-10 ng 10 pmol kullanarak hedef gen artırın.
- PCR ürünü arındırın.
- DsRNA 8 mcL saflaştırılmış PCR ürünü kullanarak sentezlerler.
- Spektrometresi ile dsRNA sayısal olarak.
2. DsRNA ile Keneler enjeksiyon.
2.1. Keneler enjeksiyon için hazırlanması.
- Öncelikle, her çözüm, tek bir 50 ml santrifüj tüpüne onları sallayarak tüp üst keneler korumak için üzerine ince bir örgü tel ekran yoluyla çözüm şişeden çözümleri bir dizi keneler yıkayın. Keneler çamaşır için çözümler dizisi, musluk suyu,% 3 hidrojen peroksit, distile su,% 70 etanol ve saf su ile iki kez daha yıkar iki yıkar.
- Kağıt havlu üzerinde kene Blot kurulayın.
- Deney bağlı olarak 20 ila 50 arasında gruba keneler Sayısı 1.25 oz plastik bardak, deneysel grup numarası ile sıkı donatılmış bir kapak ve etiket ile her gruptan keneler.
2.2. Enjeksiyon ekibi işaretleyin.
RNAi ekip üç kişiden oluşur: (1) kırmızı diş balmumu bir sayfasına yapıştırılmış çift yapışkan bant, her kene pozisyonları bir kişi, (2), sonra kenelerin izler ve keneler (3) bir kişi enjekte bir kişi enjeksiyon, keneler bunları etkinleştirmek için CO 2 nefes ve deneysel grup numarası ile etiketlenmiş bardak içine yaşayan keneler sayar. Tüm ekip üyeleri, tek kullanımlık eldivenler giymelidir.
2.3. Enjeksiyon için keneler yerleştirilmesi.
- Dumont ince forseps kullanarak kene yakalayın ve kırmızı diş balmumu 3 "x 6" levha yapıştırılmış çift yapışkan bant üzerinde ventral tarafında bir yer. Keneler 5 keneler gruplar halinde bir araya yakından konumlandırılmış.
- Tüm 5 kenelerin ağız onları daha da dizginlemek için küçük bir şerit üzerinde maskeleme bandı yerleştirin ama vücudun en enjeksiyon işlemi, kene enjektör (Şekil 1) tarafından görülebilir bu yüzden maruz bırakarak.
2.4. Keneler Enjeksiyon.
- Keneler Exoskeleton ventral yüzeyinde sağ alt kadranda enjekte edilecektir.
- İlk olarak, dış iskelet, ½ ", 29 gauge iğne (Şekil 2a) ile donatılmış bir Monoject insülin şırınga kullanarak bir delik delmek.
- 45 ° Eğimli noktası ile 1 inç, 33 gauge iğne ile ısmarlama Hamilton şırınga kullanarak (mcL başına 5 x 10 11 moleküller 5 x 10 10) (Şekil 2b) dsRNA çözüm 0.2-0.5 mcL hemen kene enjekte . Kene boşluğuna iğne dsRNA yerleştirilmesi ve saklama sigortalamak için iyi yerleştirilmiş olmalıdır. Bazı sıvı enjeksiyon yerinde (Şekil 2c) kaçmak için muhtemeldir. Üzerinde hemolimf kaybına neden olan keneler, enjekte etmek ve kene ölüme neden olabilir alınmalıdır.
- Hamilton şırınga her deney grubunda enjeksiyonları tamamladıktan sonra temizleyin. başka bir deney grubu için kullanmadan önce. Bir atık kabı içine kovmak ve 15 kez tekrarlayın sonra beher% 3 hidrojen peroksit içeren bir şırınga doldurun ve. Steril su içeren bir beher şırınga doldurun ve sonra bir atık kabı içine kovmak ve 15 kez tekrarlayın. Bükülmüş ise, piston düzgün hareket ve nazik bir dokunuş keneler enjeksiyon için gerekli cevap, çünkü Hamilton şırınga pistonu eğmemeye dikkat edin.
2.5. Enjeksiyondan sonra kene tedavisi.
- Ince forseps ile hemen çift yapışkan bant enjekte kene Pick up ve plastik bir kurtarma konteyner (yaklaşık 6 "x 6" ve keneler kaçmasını önlemek için maskeleme bandı ile halkalı) yerleştirin. Keneler, enjeksiyondan sonra kısa bir süre devre dışı olacak ama yakında çanak etrafında tarama başlamalıdır.
- Nefes kurtarma konteyner keneler etkinleştirilmesine yardımcı olmak için onları yerleştirerek hemen sonra kenelerin üzerine 2 CO. Sonra, tarama ve keneler aktif enjeksiyon yara hızla iyileşir ve bunlar büyük olasılıkla hayatta kalacaktır.
- Her deney grubu sayısına göre keneler sayın ve sıkıca monte kapaklı etiketli bir plastik bardak koyun. Yedek keneler herhangi bir sonraki deney grubu enjekte önce öldüğünü herhangi bir yerine enjekte edilmelidir.
2.6. Tutarak işaretleyin.
- Nem odasında keneler (12saat ışık Yeri: 22-25 az 12 saat karanlık fotoperiyodun ° C ve% 95 bağıl humidity) ve 1 gün için basılı tutun.
- Yeri keneler, kene besleme hücreleri için bir deney grubu, bir koyun yapıştırılmış ve onları eşit sayıda erkek veya kadın uninjected keneler (enjekte değildi hangisi seks) ile beslenirler. Tıka basa beslemek Kadın keneler, koyun, beslenme 10 gün ya da kontrolü kadın sonra çıkarılır bu konak toplanan ve tartılır düştü.
- Kartonları keneler yerleştirin ve koloni gelişimine tamamlanıncaya kadar nem odasında tutun. Yöntemlerinin koloni ağırlık gruptaki tüm keneler tarafından üretilen yumurta kitle tarafından değerlendirin.
2.7. RNAi sonra kene fenotip analizi.
- Beslenmeden sonra fenotip kene, keneler, kene kilo yöntemlerinin koloni ve yumurta doğurganlık hayatta sayısını belirleyen değerlendirin. Ancak, çalışmanın hedeflenen gen ve hedeflerine bağlı olarak diğer analizler yapılabilir.
3. RT-PCR ile gen susturma Onayla Analizi.
- Beslendikten sonra, kontrol enjekte ve dsRNA enjekte grupların bireysel kene tükürük bezleri ve bağırsaklar parçalara ayır.
- Bireysel doku örneklerinden total RNA ayıklayın.
- GenNorm yöntemi (Bio-Rad iQ5 Standart Edition Sürüm 2.0 tarafından uygulanan ddCT) yöntemini kullanarak gerçek zamanlı RT-PCR ile bireysel dokularda hedef gen transkript analiz ve kene 16S karşı RNA düzeyleri normale rRNA.
- Her örnek için aynı sıcaklık aralığında sürekli amplikonlarının doğasını sadece bir Amplikon oluşan olduğundan emin olmak için reaksiyonun sonunda ve disosiasyon eğrileri çalıştırın.
- MRNA düzeyleri kontrol dsRNA enjekte keneler Öğrenci `s, t-testi (P = 0.05) kullanılarak enjekte arasında (normalize Ct değerleri) karşılaştırın.
4. Temsilcisi Sonuçlar:
Protokolü burada RNAi için, birçok farklı ixodid kene türlerinde (Tablo 1) laboratuvarda kullanılan olmuştur nitelendirdi. Kene enjekte dsRNA miktarı kene boyutu ile değişir; büyük kene türlerinin daha büyük bir hacim barındırabilir. Negatif kontrol keneler alakasız bir dsRNA ile enjekte edilmelidir. Subolesin 14-19,22-25,27-32,34 ve beta-aktin 20,21 gibi birçok dsRNAs pozitif kontrol olarak kullanılabilir. Karıştırma dsRNA çözümler önlemek için tedaviler arasında şırınga yıkamak için önemli olduğunu unutmayın. Protokolü doğru yapılırsa,% 5 oranında daha az ölüm, 24 saat sonra enjeksiyon prosedürü elde edilmelidir. Keneler gen demonte sonra tipik bir fenotip için ekran koruyucu antijenler kene dsRNA havuzları enjekte keneler bir panel ile Şekil 3 gösterilmiştir.
| Türlerin işaretleyin | dsRNA enjekte | Referanslar |
| Ixodes scapularis | cDNA kütüphanesi, subolesin, aktin, nükleotidaz, NF-kB, akirin | 21, 22, 29, 30 |
| Dermacentor variabilis | subolesin, GST, ubikuitin, vATPase, selenoproteinlerin M ve W2A, hematopoietik kök / progenitör hücreleri aktin Proteazom 26S subunit, ferritin1, varisin, akirin, protein gibi | 15, 19, 22, 24, 26, 30-32 |
| Dermacentor marginatus | subolesin | 22 |
| Amblyomma americanum | cDNA kütüphanesi, subolesin, akirin | 17, 22, 30 |
| Amblyomma hebraeum | subolesin, voraxin | 28 |
| Rhipicephalus sanguineus | Rs86, subolesin | 22, 23 |
| Rhipicephalus Microplus | GST, ubikuitin, selenoprotein, Bm86, Bm91, subolesin, GI, GIII, EF1a flagelliform ipek proteini, von Willebrand faktör | 16, 18, 25, 27 |
| Rhipicephalus annulatus | ubikuitin, subolesin, EF1a, GIII | 16 |
(Tablo 1). RNAi protokolü kullanılan edildiği türlerin işaretleyin.
Şekil 1 kırmızı diş balmumu bir sayfasına yapıştırılır çift yapışkan bant keneler Yerleştirme, ventral tarafta. Keneler, küçük bir şerit maskeleme bandı enjektör enjeksiyon sırasında vücut kene gözlemlemek için izin verirken, keneler daha da güvenli amacıyla ağız üzerine yerleştirilir, sonra, 5 gruplar halinde yerleştirilir.
Şekil 2 enjeksiyon prosedürü insülin sy kene dış iskelet (a) sağ alt kadranda piercingringe bir enjeksiyon sitesi oluşturmak için 29 gauge iğne ile donatılmış, (b), (c) en olası kene hemolimf bazı kaçak / 33 gauge iğne ile Hamilton şırınga kullanarak bu sitede dsRNA hemen enjeksiyon akışkanlar.
Şekil 3 kene altı grup RNAi Amblyomma americanum kene koruyucu antijenler için ekran için kullanılan hangi bir panel. Keneler de fenotipik değişiklikler olumlu subolesin RNAi kontrolü ve olumsuz ilgisiz dsRNA kontrol ile karşılaştırıldığında görülebilir. Bu deneyde, her grubun kene ölüm, ağırlıklar ve yöntemlerinin koloni RNAi etkisi istatistiksel olarak analiz edildi.
Discussion
Diğer yöntemlerle keneler 14, 33 RNAi için tarif olmasına rağmen, dsRNA enjeksiyon beslenmemiş (Tablo 1) ve beslenen keneler 16,25,34 hem de en yaygın kullanılan Burada anlatılan. RNAi kene genin fonksiyonu ile çalışma, kene patojen arayüzü karakterizasyonu ve tarama ve kene koruyucu antijenler 14,35 karakterizasyonu için değerli bir araç olarak görülmüştür. Özellikle, RNAi keneler 35 fonksiyonel analizleri için en değerli bir araç haline gelmiştir.
Metodolojik, RNAi muhtemelen bireylerin çok sayıda gen demonte izin verebilir daha verimli yöntemler dönüşecek. Keneler dsRNA bağlı RNAi mekanizması, daha iyi anlaşılmasına ve bu türün 35,36 bu genetik yaklaşım kullanımı katkıda bulunmak için rafine edilmesi gerekir . Keneler de RNAi hedef etkileri ölçüde de tam 14,27 ele olması gereken önemli bir sorudur. Son olarak, RNAi büyük olasılıkla onay gen regülasyonu ve sistem biyolojisi çalışma kapsamlı katkılar sağlayacak ve kene patojen arayüzü ve kene istilası ve iletim kene kaynaklı patojenlerin kontrolü için aşı geliştirilmesi üzerinde bir etkisi olabilir.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Biz laboratuarımızda üyeleri, verimli tartışmalar ve teknik yardım için teşekkür ederim. Bu video sunum Araştırma ve Veteriner patobiyolojisi Anabilim Dalı Dekan Yardımcısı, Veteriner Sağlık Bilimleri Merkezi, Oklahoma State University tarafından desteklenmiştir. Araştırma Ministerio de Ciencia e Innovación, İspanya (proje BFU2008-01244/BMC), JF CSIC intramural proje PA1002451 tarafından finanse edildi, Walter R. Sitlington KMK, CVHS 2009 RAC hibe, OAES Gıda Hayvancılık Araştırma Başkanı donatılmış Hayvan Sağlığı Fonları ve USDA, Ulusal Araştırma Girişimi Rekabetçi Grant, No 2.007-04.613.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Access RT-PCR system | Promega | A1250 | |
| Purelink PCR purification kit | Invitrogen | K3100-02 | |
| Megascript RNAi kit | Ambion | AM1626M | |
| Red dental wax | Electron Microscopy Sciences | 72674 | |
| Plastic cups, 1.25 oz and lids | Solo Cup Company, Urbana Ill. | ||
| Fine forceps | Electron Microscopy Sciences | Various | |
| Insulin syringe | Monoject | Fitted with a ½", 29 gauge needle | |
| Hamilton syringe | Hamilton | 701SN,33/.375”/45DGR | Custom made |
| TriReagent | Sigma | 93289 | |
| iScript One-Step RT-PCR Kit with SYBR Green | Bio-Rad | 170-8892 | |
| Real-time PCR detection system | Bio-Rad | Several | Please refer to http://www.bio-rad.com/ |
References
- de la Fuente, J. Overview: Ticks as vectors of pathogens that cause disease in humans and animals. Front. Biosci. 13, 6938-6946 (2008).
- Peter, R. J. mosquito control-Lessons from the past, solutions for the future. Vet. Parasitol. 132, 205-215 (2005).
- Barker, S. C., Murrell, A. Systematics and evolution of ticks with a list of valid genus and species names. Parasitol. 129, S15-S36 (2004).
- Willadsen, P. Tick control: Thoughts on a research agenda. Vet. Parasitol. 138, 161-168 (2006).
- de la Fuente, J., Kocan, K. M. Strategies for development of vaccines for control of ixodid tick species. Parasite Immunol. 28, 275-283 (2006).
- Fire, A. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-811 (1998).
- Cerutti, H. RNA interference: traveling in the cell and gaining functions. Trends Genet. 19, 39-46 (2003).
- Kavi, H. H.
- Mello, C. C., Conte, D. J. r
- Zhou, D. RNA interference and potential applications. Curr. Top. Med. Chem. 6, 901-911 (2006).
- Ramakrishnan, V. G. Application of RNA interference in tick salivary gland research. J. Biomol. Tech. 16, 297-305 (2005).
- Aljamali, M. N. RNA interference: applicability in tick research. Exp. Appl. Acarol. 28, 89-96 (2002).
- Aljamali, M. N. RNA interference in ticks: a study using histamine binding protein dsRNA in the female tick Amblyomma americanum. Insect. Mol. Biol. 12, 299-305 (2003).
- de la Fuente, J. RNA interference for the study and genetic manipulation of ticks. Trends Parasitol. 23, 427-433 (2007).
- de la Fuente, J. Functional genomic studies of tick cells in response to infection with the cattle pathogen, Anaplasma marginale. Genomics. 90, 712-722 (2007).
- AlmazäN, C. Identification and characterization of Rhipicephalus (Boophilus) microplus candidate protective antigens for the control of cattle tick infestations. Parasitol. Res. 106, 471-479 (2010).
- de la Fuente, J. Identification of protective antigens by RNA interference for control of the lone star tick, Amblyomma americanum. Vaccine. 28, 1786-1795 (2010).
- Zivkovic, Z. Differential expression of genes in salivary glands of male Rhipicephalus (Boophilus) microplus in response to infection with Anaplasma marginale. BMC Genomics. 11, 186-186 (2010).
- de la Fuente, J. Reduction of tick infections with Anaplasma marginale and A. phagocytophilum by targeting the tick protective antigen subolesin. Parasitol. Res. 100, 85-91 (2006).
- Narasimhan, S. Disruption of Ixodes scapularis anticoagulation by using RNA interference. Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 101, 1141-1146 (2004).
- de la Fuente, J. RNA interference screening in ticks for identification of protective antigens. Parasitol. Res. 96, 137-141 (2005).
- de la Fuente, J. The tick protective antigen, 4D8, is a conserved protein involved in modulation of tick blood ingestion and reproduction. Vaccine. 24, 4082-4095 (2006).
- de la Fuente, J. Synergistic effect of silencing the expression of tick protective antigens 4D8 and Rs86 in Rhipicephalus sanguineus by RNA interference. Parasitol. Res. 99, 108-113 (2006).
- de la Fuente, J. Autocidal control of ticks by silencing of a single gene by RNA interference. Biochem. Biophys. Res. Commun. 344, 332-338 (2006).
- Nijhof, A. M. Bm86, Bm91 and subolesin, in the silencing of the tick protective antigens. Int. J. Parasitol. 37, 653-662 (2007).
- Kocan, K. M. Silencing of the defensin, varisin, in male Dermacentor variabilis by RNA interference results in reduced Anaplasma marginale infections. Exp. Appl. Acarol. 46, 17-28 (2008).
- de la Fuente, J. Evidence of the role of tick subolesin in gene expression. BMC Genomics. 9, 372-372 (2008).
- Smith, A. The impact of RNA interference of the subolesin and voraxin genes in male Amblyomma hebraeum (Acari: Ixodidae) on female engorgement and oviposition. Exp. Appl. Acarol. 47, 71-86 (2009).
- Galindo, R. C. Tick subolesin is an ortholog of the akirins described in insects and vertebrates. Dev. Comp. Immunol. 33, 612-617 (2009).
- Canales, M. Conservation and immunogenicity of the mosquito ortholog of the tick protective antigen, subolesin. Parasitol. Res. 105, 97-111 (2009).
- Kocan, K. M. Silencing of genes involved in Anaplasma marginale-tick interactions affects the pathogen developmental cycle in Dermacentor variabilis. BMC Dev. Biol. 9, 42-42 (2009).
- Zivkovic, Z. Subolesin expression in response to pathogen infection in ticks. BMC Immunol. 11, 7-7 (2010).
- Karim, S. Functional genomics tool: gene silencing in Ixodes scapularis eggs and nymphs by electroporated dsRNA. BMC Biotechnol. 10, 1-1 (2010).
- Kocan, K. M. Transovarial silencing of the subolesin gene in three-host ixodid tick species after injection of replete females with subolesin dsRNA. Parasitol. Res. 100, 1411-1415 (2007).
- de la Fuente, J. Targeting the tick-pathogen interface for novel control strategies. Front. Biosci. 13, 6947-6956 (2008).
- Kurscheid, S. Evidence of a tick RNAi pathway by comparative genomics and reverse genetics screen of targets with known loss-of-function phenotypes in Drosophila. BMC Mol. Biol. 10, 26-26 (2009).
