Deze video toont de procedure voor het isoleren van hele hersenen van volwassen Drosophila als voorbereiding voor het opnemen van enkele neuronen met behulp van standaard hele cel-technologie. Het bevat beelden van GFP gelabelde cellen en neuronen bekeken tijdens het opnemen.
Abstract
In deze video, tonen we de procedure voor het isoleren van hele hersenen van volwassen Drosophila als voorbereiding voor het opnemen van enkele neuronen. We beginnen met het beschrijven van de oplossing ontleden en inname van de volwassen vrouwtjes in onze studies. De procedure voor het verwijderen van de hele hersenen intact, met inbegrip van zowel optische kwabben, wordt geïllustreerd. Dissectie van de bovenliggende trachea wordt ook getoond. De geïsoleerde brein is niet alleen klein, maar heeft speciale zorg in de behandeling in dit stadium om schade aan de neuronen te voorkomen, waarvan vele zich dicht bij de buitenkant van het weefsel. We laten zien hoe een speciale houder ontwikkeld wordt gebruikt om de hersenen in de opname kamer te stabiliseren. Een standaard elektrofysiologie opgezet wordt gebruikt voor het opnemen van enkele neuronen of paren van neuronen. Een TL-beeld, gezien door de opname microscoop, uit een GAL4 lijn rijden GFP-expressie (GH146) illustreert hoe projectie neuronen (PNS) worden geïdentificeerd in de live hersenen. Een hoog vermogen Nomarski beeld toont een weergave van een enkel neuron die wordt gericht op hele cel opnemen. Wanneer de hersenen met succes is verwijderd zonder schade, de meerderheid van de neuronen zijn spontaan actief, vuren actiepotentialen en / of de uitstalling van spontane synaptische input. Deze in situ voorbereiding, waarin whole cell-opname van de geïdentificeerde neuronen in de hele hersenen kunnen worden gecombineerd met genetische en farmacologische manipulaties, is een bruikbaar model voor het verkennen van cellulaire fysiologie en plasticiteit in het volwassen CZS.
Protocol
I. dissectie van hersenen van volwassen vliegen Plaats een kleine druppel (~ 100 ul) van het ontleden van oplossing in het midden van een 35 mm petrischaal. Catch volwassen vrouwelijke gebruik aspirator. Onder dissectiemicroscoop, gebruik maken van twee injectienaalden met de vlieg onthoofden. Plaats het hoofd in een kleine daling van het ontleden van zout (met papaïne toegevoegd) in een petrischaal. Positie van hoofd met de slurf naar bodem van de schaal. Houd de cutic…
Discussion
De geïsoleerde hele brein voorbereiding illustreren we in deze video laat de beoordeling van cellulaire mechanismen die ten grondslag liggen prikkelbaarheid en synaptische transmissie in geïdentificeerde neuronen, inclusief die in de olfactorische verwerking paden, in de volwassen Drosophila hersenen (Gu en O Dowd, 2006). Deze aanpak is complementair aan van de neuronale activiteit studie in de hersenen van intacte volwassen Drosophila (Wilson et al 2004), in vrijwel dezelfde manier opnamen van neuronen in een plakje hersenen van zoogdier…
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door een NIH subsidie NS27501 naar DKOD. Extra ondersteuning voor dit werk werd geleverd door een HHMI professor Grant Program voor DKOD.
Materials
Material Name
Type
Company
Catalogue Number
Comment
#5 Foceps
Tool
FST by DUMONT
No. 11251-10
Be careful, never damage the fine tips of forceps
Papain
Reagent
Worthington
3126
20 U/ml activated by 1 mM L-cysteine
Dissecting microscope
SMZ-2B Model:C-PS
Nikon
Equipped with gooseneck fiber optic lights positioned a low angle
Needle & Syringe
PrecisionGlide®?, Becton Dickinson & Co
305175 & 309602
Cheap and durable
Upright microscope
Axioskop2 FS plus
Zeiss
Equipped with a fixed stage, 40X water immersion objective, Nomarski optics, and fluorescent lamp